一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用制造技术

一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用，其属于精细化工领域。该特异性探针底物是1,3‑二氯‑7‑羟基‑9,9‑二甲基‑2(9H) ‑吖啶酮类化合物酯类衍生物，其可用于检测不同生物样品中HSA的存在与否及其活力的定量测定。酶活具体测定流程如下：选择1,3‑二氯‑7‑羟基‑9,9‑二甲基‑2(9H) ‑吖啶酮酯类衍生物水解反应为探针反应，选择适宜底物浓度在线性反应区间内通过定量检测单位时间内其水解代谢产物1,3‑二氯‑7‑羟基‑9,9‑二甲基‑2(9H) ‑吖啶酮的生成量来测定各生物样品中HSA的实际活性。该探针可用于不同来源生物样本中HSA活性的定量评估。

【技术实现步骤摘要】
一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用
本专利技术涉及一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用，其属于精细化工领域。
技术介绍
人血清白蛋白（humanserumalbumin,HSA）是人体内一种依靠17个二硫键将585个氨基酸键连而成的环状蛋白，分子量为66kDa。HSA仅在肝脏中合成，正常人HSA的合成速率为12-25g/d。HSA合成后很快分泌到血浆和组织液中，是血浆中含量最丰富的蛋白，它在健康人血浆中的含量为35-50g/L，约占血浆总蛋白量的一半以上。人血浆中HSA含量受营养和健康状态的影响，是血常规检查重要指标之一。HSA参与人体内多种生理、病理过程，包括：维持血浆胶体渗透压，作为内源性和外源性化合物（胆红素、脂肪酸、维生素、和药物分子等）的转运载体，此外，HSA还具有维持微血管的通透性、维持血浆酸碱平衡等作用。体液中的HSA含量与多种疾病的发生、发展有关，如血浆和尿液中HSA的含量可以作为诊断和预测包括肝硬化、慢性肝炎、风湿性关节炎、肾脏损伤、糖尿病、高血压等多种疾病的生物标志物。目前，HSA定量方法包括：染料结合法、体积排阻色谱法、免疫化学法以及蛋白质质谱法。染料结合法和体积排阻色谱法虽然操作起来较为简便、成本较低，但是特异性较差，容易受生物样品中其他物质的干扰。而免疫化学和基于质谱的定量方法虽然特异性较好，但操作复杂耗时、成本较高，需要特定的试剂和仪器。当前临床使用的探针分子，包括溴甲酚绿、AB580等都是基于HSA与探针分子的结合特征设计的，而探针与HSA结合在一定程度上受到其他能与HSA结合的物质的干扰。本专利技术提供了一类1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物的酯类衍生物及其作为HSA荧光探针底物的应用，其经HSA水解后可生成具有荧光发射性质的水解产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性评价快速高效等特点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一类检测人血清白蛋白(HSA)的高特异性荧光探针及其应用，该底物原型和水解产物的荧光荧光属性具有明显差异。利用该探针反应可对多种生物体系中HSA的分布和功能进行定量评价。本专利技术的目的在于提供一类检测人血清白蛋白(HSA)的高特异性荧光探针及其应用，该底物的酯键在人源血液、尿液或细胞中可被HSA特异性水解为相应水解产物，且产物具有荧光；该底物是以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物为原料，通过酯化反应获得相应羟基酯类衍生物，其结构通式如式（1）所示，其中，R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。式（1）如当R为（4-苯基）苯基时，该底物为1,3-二氯-7-（4-苯基苯甲酰氧基）-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮（DDAP）。本专利技术还提供了HSA的特异性荧光探针底物的应用，该底物作为HSA的特异性底物，发生水解反应，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中HSA的活性；具体测定方法为：——体系中以1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物7位羟基的酯类衍生物作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10~10Km；单点测定时底物浓度优选Km。——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20oC至60oC之间，优选37oC为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5~10.5之间，优选pH7.4为最优反应pH值；——反应时间为5~120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20%时终止反应；——测定单位时间内水解产物生成量作为HSA活性的评价指标。本专利技术提供的人血清白蛋白特异性荧光探针底物的应用，所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1%~20%之间。本专利技术提供的人血清白蛋白特异性荧光探针底物的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长550~600nm，在630~700nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应HSA活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中HSA酶活的定量测定。该特异性探针反应可用于重组白蛋白、人及动物组织制备液及各类组织细胞中HSA酶活的定量测定。采用重组单酶代谢反应，以及酶反应动力学等多方面的证据，证明1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物羟基的酯类衍生物可特异性的经HSA代谢，生成相应的水解产物。作为高特异性的HSA的荧光探针底物，该化合物可以用来检测HSA的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的HSA重组酶的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的组织微粒体、S-9等制备物中HSA的活性标定。选用本专利技术所述HSA的特异性探针底物检测HSA体外活性具有以下突出优势：(1)高特异性：1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物7-羟基的酯类衍生物可被HSA高特异性地代谢成一个代谢产物，即7位酯键断裂的水解产物。(2)廉价易得：1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮类化合物羟基的酯类衍生物及其水解产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。(3)高灵敏度：具有1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮母核结构的化合物均具有良好的荧光发射光谱特性（630～700nm），该底物及其水解代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测，同时可通过绘制标准曲线进行定量测定。附图说明图1单酶选择性。图21,3-二氯-7-（4-苯基苯甲酰氧基）-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮与人血清白蛋白浓度线性关系。图3DDAP法与BCG法测试相关性。图4DDAP法和BCG法识别正常HSA和变性HAS。图5定量检测人肝癌分泌HSA能力。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，并不因此而限制本专利技术。实施例11,3-二氯-7-乙酰氧基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮（DDAA）的合成在25mL两口瓶中加入0.25mmol的1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮、0.31mmol的三乙胺和10mL二氯甲烷，将0.3mmol的乙酰氯溶解在5mL二氯甲烷中，在氮气保护和冰浴的条件下，30min内逐渐滴入反应瓶，在此温度下搅拌1h，然后常温搅拌过夜。减压旋转蒸发除去溶剂，剩余固体采用柱层析法提纯，展开剂为乙酸乙酯：石油醚=1：5（v：v），得到45.9mg橘黄色固体（收率52.5%）。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(d,J=8.5Hz,1H),7.63(s,1H),7.24(d,J=2.3Hz,1H),7.13(dd,J=8.5,2.3Hz,1H),2.34(s,3H),1.88(s,6H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ173.16,168.81,153.32,149.81,140.33,139.45,138.56,137.38本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类检测人血清白蛋白(HSA)的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：该荧光探针的酯键可被HSA特异性水解为相应水解产物并产生产物对应的荧光，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定不同样品中HSA的活性；

【技术特征摘要】
1.一类检测人血清白蛋白(HSA)的高特异性荧光探针的应用，其特征在于：该荧光探针的酯键可被HSA特异性水解为相应水解产物并产生产物对应的荧光，通过定量检测单位时间内水解产物的生成量来测定不同样品中HSA的活性；式（1）该荧光探针为1,3-二氯-7-羟基-9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮酯类衍生物，其结构通式如式（1）所示，其中R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、苯基、对甲基苯基、对乙基苯基、对丙基苯基、对己基丙基、对硝基苯基、对氯苯基、1-萘基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一种。2.根据权利要求1所述的一类检测人血清白蛋白的高特异性荧光探针的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔京南，冯磊，王铮，
申请(专利权)人：苏州尚稷电子科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32