去除血清白蛋白及其融合蛋白中杂质的方法技术

本发明专利技术涉及去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法，该方法的特征在于将血清白蛋白或其融合蛋白吸附或结合于填料填料上，使用包含适量蛋白变性剂的去杂质洗液洗去血清白蛋白或其融合蛋白中包裹的杂质，然后使用不含变性剂的蛋白复性液重新使得血清白蛋白或其融合蛋白复性，最后使用合适的蛋白洗脱液将血清白蛋白或其融合蛋白从填料上洗脱下来。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的去除方法。
技术介绍
血清白蛋白是脊椎动物血浆中含量最丰富的蛋白质。人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，相对分子质量约为66.5kD，占血浆总蛋白的60％左右。人血清白蛋白是血液系统的重要组分，具有结合、运输内源性与外源性物质，维持血浆pH和血液胶体渗透压，清除自由基及影响动脉血管的渗透性等多种生理功能。[Peters,T.(1995).All About Albumin:Biochemistry,Genetics and Medical Applications,Academic Press,San Diego]人血清白蛋白在现代医学中是一种重要的临床生物制品，主要作为血浆容量扩充剂，可用于治疗出血性休克、脑缺血、烧伤、红细胞过多症、白蛋白过少症等多种疾病。作为一种脂肪酸等物质的输运蛋白，白蛋白、尤其是从毕赤酵母中获得的重组白蛋白、常常包裹有一些色素，导致白蛋白呈现为黄色、甚至是深黄色，而不是普通蛋白的无色、或淡黄色(高浓度时)。人血清白蛋白临床使用量大，每针剂量通常达10g，而大多数蛋白质药物如细胞因子、激素的剂量仅为μg或ng级，因此相对其它蛋白质药物来说，人血清白蛋白的纯度要求更为严格。产品中即使有害杂质为0.001％，每针剂仍会有0.1mg的杂质被注入体内，对病人可造成极大的危害。无论是从血浆中提取的人血清白蛋白(pHSA)，还是利用基因工程制备的重组人血清白蛋白(rHSA)，HSA的去除杂质的技术都是影响其产业化的一种关键技术。只有降低其去杂质技术成本，才能使HSA更广泛的应用于医疗，更好的服务于病人。因此，国内外已有许多科研机构致力于此方面的研究，但效果不甚理想。通过世界各国科研者对重组白蛋白的努力研究，已经摸索出一些重组白蛋白的纯化方法。重组白蛋白的常见纯化步骤：对分离出来的rHSA进行阳离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析、盐析等初步的纯化步骤，然后经过螯合树脂、硼酸或硼酸盐处理或二次疏水层析等进一步的纯化过程，得到稳定的、较高纯度的rHSA。日本的Green Cross公司第一步运用STREAMLINE纯化方法，将68℃条件下加热灭活蛋白酶的发酵液通过阳离子扩张床进行纯化，目的rHSA吸附，酵母菌体及其它杂质流穿，再经过疏水及阴离子交换层析得到rHSA，从而缩短了纯化周期。英国的Delta公司申请的PCT专利WO00/44772采用的纯化步骤是SP FF阳离子层析(洗脱含rHSA的结合组分)、DEAE-FF阴离子层析(洗脱含rHSA的结合组分)、DBA亲和层析(洗脱含rHSA的结合组分)、PBA亲和层析(收集流穿)、SP-FF阳离子层析(收集流穿)、DEAE-FF阴离子层析(收集流穿)，最后得到单体纯度大于99.9％的rHSA。目前虽然日本和美国对重组人血清白蛋白的纯化工艺处于世界领先地位，但是其生产工艺成本较高，步骤繁琐，严重制约着重组人血清白蛋白的大规模生产。另外重组血清白蛋白融合蛋白也具有很好的药用价值。如干扰素-ɑ(IFN-ɑ)有着很好的抗病毒活性，对乙型肝炎和丙型肝炎有很好的疗效。但由于其体内半衰期非常短，不仅影响其疗效而且给患者带来不便。研究人员将干扰素ɑ-2b基因与HSA基因融合，利用毕赤酵母作为宿主细胞表达融合蛋白，则会使其半衰期大大延长，而且干扰素ɑ-2b的体内活性也会增强。无论是血清白蛋白还是重组血清白蛋白融合蛋白的生产，都面临着清除杂质的难题。白蛋白中的杂质有两种，一种与白蛋白没有直接相互作用的其他蛋白或小分子，这些蛋白可以使用常规的沉淀、色谱分离等方法去除。另一种是包裹在白蛋白内部、或与白蛋白有很强相互作用的小分子，如色素等，这是由于白蛋白作为一种输运蛋白的特性导致的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法。使用本专利技术方法，可以有效去除血清白蛋白或其融合蛋白中包裹的内源性杂质，如色素等。本专利技术的技术方案为：一种去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)使用去杂质洗液对结合或吸附在填料上的血清白蛋白或其融合蛋白进行去杂质操作；(2)然后使用蛋白复性液对可逆变性的血清白蛋白或其融合蛋白进行复性；(3)然后用蛋白洗脱液将血清白蛋白或其融合蛋白从填料上洗脱下来。其中所述去杂质洗液是可以使血清白蛋白或其融合蛋白可逆地变性的溶液，所述蛋白复性液是不含有蛋白变性剂的溶液，所述蛋白洗脱液是能够将蛋白从填料上洗脱下来的溶液。在优选的实施方案中，所述去杂质洗液包含蛋白变性剂、无机溶剂和有机溶剂。蛋白变性剂包括但不限于选自尿素、盐酸胍、低pH变性盐，丙酮或适宜浓度的碱液中的一种或几种。术语“低pH变性盐”的含义可由其字面意思来理解，即pH值较低的可以使蛋白质变性的盐。有机溶剂包括但不限于选自酒精、甘油、异丙醇或肉豆蔻酸的一种或几种。无机溶剂包括但不限于水和/或液氨。本领域技术人员可以通过常规实验来确定蛋白质变性剂和有机溶剂的适宜浓度。在优选的实施方案中，蛋白变性剂尿素的浓度在4-8M的范围内，更优选为约6M。在优选的实施方案中，有机溶剂如酒精的浓度为3％--60％，更优选为10％-33％在更优选的实施方案中，所述去杂质洗液包含适宜浓度的尿素和酒精。更优选地，所述去杂质洗液包含30-33％的酒精，6M尿素。其中酒精浓度的百分比为体积/体积比。在一个特别优选的实施方案中，本专利技术的去杂质洗液含有6M尿素、30％酒精、20mM Tris-HCl(pH 7.4)。在另一个特别优选的实施方案中，本专利技术的去杂质洗液含有33％酒精、6M尿素、20mM Tris-HCl(pH 7.4)。本专利技术中，蛋白质复性液可以是本领域中常用于使蛋白质复性的溶液，其成分可由本领域技术人员容易地确定。蛋白质复性液可以是缓冲液，也可以不是缓冲液。在本专利技术的优选实施方案中，蛋白质复性液可以是所述填料(也可以是装填有该填料的层析柱或色谱柱)的平衡缓冲液。在一个特别优选的实施方案中，本专利技术的蛋白质复性液含有20mM Tris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl。本专利技术中，蛋白质洗脱液可以是本领域中常用于从填料(也可以是装填有该填料的层析柱或色谱柱)上洗脱蛋白质的洗脱液。在一些实施方案中，所述蛋白质洗脱液含有咪唑。在进一步优选的实施方案中，所述蛋白质洗脱液含有浓度150-750mM的咪唑，更优选含有浓度为约500mM的咪唑。在一个特别优选的实施方案中，本专利技术的蛋白质洗脱液含有20mM Tris-HCl pH 7.4、500mM NaCl、500mM咪唑。本专利技术中，术语“填料”指所有能够结合或吸附血清白蛋白或其融合蛋白的物质。填料包括但不限于：亲和层析填料如Ni-NTA填料、抗白蛋白抗体填料；离子交换色谱填料、共价色谱填料。在一些实施方案中，所述填料被装填于层析柱或色谱柱中，待去除杂质的血清白蛋白或其融合蛋白结合或吸附于该层析柱或色谱柱中。术语“亲和层析”指层析填料是用具有特殊结构的亲和分子制成的固相吸附剂，当要被分离的物质通过层析填料时，与吸附剂具有亲和力的物质就会被吸附而滞留在层析填料中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)使用去杂质洗液对结合或吸附在填料上的血清白蛋白或其融合蛋白进行去杂质操作；(2)然后使用蛋白复性液对可逆变性的血清白蛋白或其融合蛋白进行复性；(3)然后用蛋白洗脱液将血清白蛋白或其融合蛋白从填料上洗脱下来。其中所述去杂质洗液是可以使血清白蛋白或其融合蛋白可逆地变性的溶液，所述蛋白复性液是不含有蛋白变性剂的溶液，所述蛋白洗脱液是能够将蛋白从填料上洗脱下来的溶液。

【技术特征摘要】
1.去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)使用去杂质洗液对结合或吸附在填料上的血清白蛋白或其融合蛋白进行去杂质操作；(2)然后使用蛋白复性液对可逆变性的血清白蛋白或其融合蛋白进行复性；(3)然后用蛋白洗脱液将血清白蛋白或其融合蛋白从填料上洗脱下来。其中所述去杂质洗液是可以使血清白蛋白或其融合蛋白可逆地变性的溶液，所述蛋白复性液是不含有蛋白变性剂的溶液，所述蛋白洗脱液是能够将蛋白从填料上洗脱下来的溶液。2.权利要求1的方法，其中所述去杂质洗液包含蛋白变性剂、有机溶剂和无机溶剂。3.权利要求2的方法，其中所述蛋白质变性剂是选自尿素、盐酸胍、低pH变性盐，丙酮或适宜浓度的碱液中的一种或几种；优选，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄明东，李世杰，袁彩，陈卓，陈锦灿，雪光浦，郑科，
申请(专利权)人：中国科学院福建物质结构研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35