一种牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用，该制备方法采用廉价的原硅酸四乙酯为原料，使原硅酸四乙酯在氨水的作用下水解合成纳米级的二氧化硅粒子；随后利用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷在二氧化硅粒子的表面键合上氨基,得到NH2‑SiO2；再然后将BSA键合到NH2‑SiO2上，得到BSA‑SiO2。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。利用BSA‑SiO2来检测BSA的该检测方法，利用了抗原与抗体的特异性结合反应，同时利用HRP来标记抗体，实现可视化检测，特异性强，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫分析领域，具体而言，涉及一种牛血清白蛋白检测探针及其制备方法和应用。
技术介绍
在培养细胞生产疫苗的过程中，牛血清是培养基的主要成分。由于牛血清中常常含有牛血清白蛋白，因此对疫苗中残留的牛血清白蛋白(BSA)的检测是非常重要的，它直接关系到生物制品使用的安全性。但目前的检测方法都需要高昂的仪器，同时检测步骤繁琐、费时、检测条件苛刻，且检测时所使用试剂的毒性较大。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种牛血清白蛋白检测探针，这种检测探针的粒径小、结构稳定、容易保藏。这种牛血清白蛋白检测探针，检测BSA时操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的BSA进行有效检测。本专利技术的第二目的在于提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，这种制备方法步骤简单、反应条件不苛刻，容易实现，适合工业大生产，且该法所用到的溶剂对环境友好，同时通过这种方法所制备的牛血清白蛋白检测探针的粒径是纳米级的，对BSA检测的灵敏度高。本专利技术的第三目的在于提供一种牛血清白蛋白检测探针的应用，即用探针来检测待测样品中牛血清白蛋白的含量。检测BSA时操作简单、检测迅速且灵敏度高，能够对样品中很微量的BSA进行有效检测。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其包括：步骤Ⅰ：将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合后再缓慢加入原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h，再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，于20-30℃下搅拌16-24h，于40-55℃下干燥，得到氨基修饰的二氧化硅纳米粒子(NH2-SiO2)；步骤Ⅱ：将牛血清白蛋白与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，于20-30℃下搅拌1-3h；随后与氨基修饰的二氧化硅纳米粒子混合，于20-30℃下搅拌1-3h，得到牛血清白蛋白检测探针(BSA-SiO2)。一种牛血清白蛋白检测探针的应用，其包括：步骤a：用辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗牛血清白蛋白(aBSA)，得到辣根过氧化物酶标记的抗体(HRP-aBSA)；步骤b：将待测样品与辣根过氧化物酶标记的抗体混合，震荡反应4-8min；随后，再与牛血清白蛋白检测探针混合，震荡反应4-8min，离心，得到结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针(HRP-aBSA-BSA-SiO2)；步骤c：在结合辣根过氧化物酶的牛血清白蛋白检测探针中加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，静置12-18min进行显色，随后加入H2SO4终止显色，于445-455nm处检测吸光度，采用标准曲线法得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：牛血清白蛋白检测探针的制备方法中，采用廉价的原硅酸四乙酯(TEOS)为原料，使原硅酸四乙酯在氨水的作用下水解合成纳米级的二氧化硅粒子；随后利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在二氧化硅粒子的表面键合上氨基，得到NH2-SiO2；再然后将BSA键合到NH2-SiO2上，得到BSA-SiO2。这种制备方法简单、反应条件温和，容易实现，适合工业大生产。用牛血清白蛋白检测探针来检测样品中的BSA的原理是：在待测样品中加入一定量的HRP-aBSA后，一部分的HRP-aBSA与待测样品中的BSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA复合物，另一部分的HRP-aBSA游离在待测样品液中；随后，在待测样品中加入BSA-SiO2，BSA-SiO2与待测样品液中游离的那部分HRP-aBSA进行特异性结合，形成HRP-aBSA-BSA-SiO2复合物；离心、洗涤后，在所得到的HRP-aBSA-BSA-SiO2中加入TMB。TMB为HRP的底物，在与HRP-aBSA-BSA-SiO2作用后形成的产物呈蓝色，随后用H2SO4终止反应后，TMB的产物由蓝色变为黄色。采用比色法测反应液在445-455nm处的吸光度，将其数值带入由系列标准BSA溶液采用同样检测方法所得的标准曲线中，即可得出待测样品中牛血清白蛋白的含量。上述标准曲线为反比例曲线，即当待测样品中的BSA浓度越低，游离的HRP-aBSA的量就越多，用比色法所测得的吸光度值也就越高，由此可见，该吸光度值与待测样品中的BSA浓度呈反比。该检测方法利用了抗原与抗体的特异性结合反应，特异性强，同时利用HRP来标记抗体，实现特异性的可视化检测，特异性强，灵敏度高。由于牛血清白蛋白检测探针为白色的，在一定的范围内，对待测样品中是否含有牛血清白蛋白能够实现快速的肉眼可见的可视化分析。该牛血清白蛋白检测探针的稳定性强、粒径小，在溶液中的分散性好。在利用该牛血清白蛋白检测探针检测待测样品中的BSA时，操作过程简单、迅速，所需要的仪器设备仅为紫外分光光度计，检测成本低，简单易行。该方法的适用广泛、使用性强，可快速检测疫苗等生物样品中BSA的含量。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为BSA-SiO2的合成路线图；图2为利用BSA-SiO2检测待测样品的BSA的步骤图；图3为BSA-SiO2和NH2-SiO2的TEM图(A图为NH2-SiO2；B图为BSA-SiO2)；图4为BSA-SiO2和NH2-SiO2的热重分析图(a线为NH2-SiO2，b线为BSA-SiO2)；图5为实验例1中的线性拟合标准曲线。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，如图1所示，其包括：步骤Ⅰ：将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合后再缓慢加入原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h，再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，于20-30℃下搅拌16-24h，于40-55℃下干燥，得到NH2-SiO2。原硅酸四乙酯在氨水的作用下，水解生成SiO2纳米粒子。随后再与3-氨基丙基三乙氧基硅(APTES)作用，在SiO2的表面键合氨基，得到NH2-SiO2。缓慢加入TEOS乙醇溶液是为了控制反应速度，使得生成的SiO2纳米粒子的粒径小。通过本专利技术提供的合成方法，所得到的SiO2为纳米级的，进一步使牛血清白蛋白检测探针的粒径小，有利于提高检测的灵敏度和准确性。在本专利技术较佳的实施例中，为了使反应更好的进行，上述TEOS乙醇溶液为TEOS与无水乙醇按体积比1：2-3混合后的溶液。在本专利技术较佳的实施例中，为了在SiO2表面键合较多数量的氨基，上述APTES与TEOS的体积比为1：12-17。进一步优选为APTES与TEOS的体积比为1：15。SiO2表面键合氨基的数量越多，每个SiO2表面最终键合的BSA的量就会越多，能够大幅提高检测的灵敏度。为了形成粒径更小的纳米级的SiO2粒子，在本专利技术较佳的实施例中，先将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合，于20-30℃下搅拌，在45-55min内，将TEOS乙醇溶液缓慢加入上述无水乙醇与氨水混合的溶液中。将TEOS乙醇溶液的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其特征在于，其包括：步骤Ⅰ：将无水乙醇与氨水按照体积比2‑4：1混合后再缓慢加入原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20‑30℃下搅拌1h后，再与3‑氨基丙基三乙氧基硅混合，于20‑30℃下搅拌16‑24h，于40‑55℃下干燥，得到氨基修饰的二氧化硅纳米粒子；步骤Ⅱ：将牛血清白蛋白与1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺混合，于20‑30℃下搅拌1‑3h；随后与所述氨基修饰的二氧化硅纳米粒子混合，于20‑30℃下搅拌1‑3h，得到牛血清白蛋白检测探针。

【技术特征摘要】
1.一种牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其特征在于，其包括：步骤Ⅰ：将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合后再缓慢加入原硅酸四乙酯乙醇溶液，在20-30℃下搅拌1h后，再与3-氨基丙基三乙氧基硅混合，于20-30℃下搅拌16-24h，于40-55℃下干燥，得到氨基修饰的二氧化硅纳米粒子；步骤Ⅱ：将牛血清白蛋白与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合，于20-30℃下搅拌1-3h；随后与所述氨基修饰的二氧化硅纳米粒子混合，于20-30℃下搅拌1-3h，得到牛血清白蛋白检测探针。2.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其特征在于，所述原硅酸四乙酯乙醇溶液为原硅酸四乙酯与无水乙醇按体积比1：2-3混合后的溶液。3.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其特征在于，所述3-氨基丙基三乙氧基硅与所述原硅酸四乙酯的体积比为1：12-17。4.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其特征在于，在所述步骤Ⅰ中，先将无水乙醇与氨水按照体积比2-4：1混合，于20-30℃下搅拌，在45-55min内，将所述原硅酸四乙酯乙醇溶液缓慢加入上述无水乙醇与氨水混合的溶液中。5.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其特征在于，在所述步骤Ⅰ中，所述缓慢加入为逐滴加入。6.根据权利要求1所述的牛血清白蛋白检测探针的制备方法，其特征在于，在所述步骤Ⅱ...

【专利技术属性】
技术研发人员：青琳森，王乾龙，丁立生，梁健，饶亮明，李兴德，蒋立银，帅克，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，中国科学院成都生物研究所湖州生物资源利用与开发创新中心，
类型：发明
国别省市：四川;51