抗血清白蛋白的FAB-效应物部分的融合构建体及其制备方法技术

本发明专利技术涉及抗原结合片段(Fab)和包括该抗原结合片段(Fab)的Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽。本发明专利技术的Fab特异性结合血清白蛋白，从而具有延长的体内半衰期。本发明专利技术的Fab的特征在于，没有对CH1结构域和CκL结构域中的链间二硫键负责的半胱氨酸残基。本发明专利技术的Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽可在大肠杆菌E.coli的细胞周质中进行高产量生产，并且具有增加的体内半衰期。另外，本发明专利技术提供了一种产生多种Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽的大肠杆菌E.coli菌株，和一种包括所述Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽的药物组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗原结合片段(Fab)以及包括该抗原结合片段(Fab)的Fab-效应物融合蛋白。
技术介绍
抗原结合片段(Fab)的制备是最成功的单克隆抗体治疗剂之一。例如，在很多国家已经批准了阿昔单抗兰尼单抗和赛妥珠单抗(Certolizumabpegol)等为药物。此外，在欧盟，可在市场上购买包括阿昔单抗兰尼单抗和赛妥珠单抗的多克隆Fab制剂。当外源性效应物结构域与Fab形成Fab-效应物融合物形式时，外源性效应物结构域的缀合可赋予Fab治疗效果。因此，事实上，将在临床开发状态下的许多抗体片段缀合至外源性功能部分。在这样的Fab-融合蛋白构建体(或Fab-效应物部分构建体)中，抗原结合片段可提供靶标特异性的递送，并且融合蛋白或(多)肽(效应物结构域)可提供治疗效果。源自原核起源的融合结构域可包括细胞毒素，例如deBouganin(一种去免疫的植物毒素)(参见Entwistle et al.,(2012)Cancer Biother Radiopharm.27,582-92)、葡萄球菌肠毒素(SE)(参见Ilack et al.,(2003)Toxicology.185,161-174)或者假单胞菌(Pseudomonas)外毒素的突变体形式(参见Choe et al.,(1994)Cancer Res.54,3460-3467；参见Kreitman et al.,(1994)Int.J.Cancer 57,856-864)。另外，包括来自真核生物的多肽，诸如scFv(参见Lu et al.,(2002)J Immunolog Meth.267,213-226)或者细胞因子(参见Holzer et al.,(1996)Cytokine.8,214-221；参见Sjogaard et al.,(1999)Int JOncol.15,873-882)的融合结构域可起治疗剂的作用。尽管放射性同位素通常以化学方法缀合至Fab或(Fab')2片段，但是细胞毒素、细胞因子或酶以基因方式与Fab或(Fab')2融合。与scFv、Fv或dsFv不同，已知Fab分子可在大肠杆菌E.coli的细胞周质中(参见Humphreyset al.,J.Immunol.Methods.209,193-202；Carter et al.,Biotechnology(N Y).10,163167；Venturi et al.,J Mol Biol.315,1-8；Donzeau et al.,Methods Mol Biol.378,14-31)或者甚至在萤光假单胞菌Pseudomonas fluorescens中(参见Retallack et al.,Prot Exp Purif.81,157-165)以可溶性形式进行生产，很容易达到1～2g/L。目前，许多市售的生物试剂，诸如rhGH、胰岛素或多种类型的细胞因子，都是在大肠杆菌E.coli中生产的(参见Graumann and Premstaller,(2006)Biotechnol J.1,164-186；Chadd and Chamow,(2001)Curr Opin Biotechnol.12,188-194)。就这一点而言，治疗结构域与Fab片段和其他治疗剂的基因连接在新的生物药剂的开发中具有很大优势，而且在改善目前生物药物的功效上也具有很大优势。进一步地，Fab分子可与其他抗体片段，诸如scFv、Fv、dsFv或dAb融合，以制备双特异性或三特异性的抗体分子(参见Lu et al.,(2002)J ImmunologMeth.267,213-226)。但是，Fab-效应物融合蛋白(其中效应物是真核生物来源的)的表达在大肠杆菌E.coli中受到了阻碍，因为效应物结构域由于在大肠杆菌E.coli中的不恰当折叠或缺乏糖基化过程而没有生物学功能。此外，还没有对大肠杆菌E.coli的细胞周质中生产Fab-效应物融合蛋白的最优化的融合形式进行彻底的研究。分子量小于50kDa至60kDa之间的大部分血清蛋白，诸如细胞因子和生长因子，由于肾清除率，而在体内具有较短的半衰期，例如从几分钟至几小时。因此，延长治疗性多肽或蛋白的血清半衰期是生物制药研究中最热衷研究的领域之一(参见Kontermann,(2012)Wiley,ISBN:978-3-527-32849-9)。为此，已经开发了多种方法，包括聚乙二醇化、聚唾液酸化、羟基化(HESylation)、糖基化，或与柔性且亲水性的氨基酸链(500～600个氨基酸)融合的重组的PEG类似物(参见Chapman,2002；Adv Drug Deliv Rev.54.531～545；Schlapschy et al.,(2007)Prot Eng Des Sel.20,273～283；Contermann(2011)Curr Op Biotechnol.22,868～876；Jevsevar et al.,(2012)Methods Mol Biol.901,233～246)。进一步地，也已直接或间接利用了FcRn介导的再循环机制，以延长治疗性蛋白的体内半衰期。在血清蛋白中，已知人类血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白(尤其是IgG)在FcRn介导的再循环机制中具有非常长的半衰期。在人体中，白蛋白的血清半衰期是19天，而依赖于IgG的子类，IgG分子的血清半衰期在一周至几乎4周之间。因此，已经使用这两种分子作为融合伴侣，以延长治疗性蛋白和/或(多)肽的半衰期。在大肠杆菌E.coli的细胞质或细胞周质中制备的、经体外折叠过程之后的重组hGH(～19kDa)已经在临床上用来治疗婴儿和成人中由于缺乏生长激素而引起的疾病(参见Blethen et al.,(1997)J.Clin.Endocrinol.Metab.82,418-420)。rhGH给药中的一个主要不便之处是，由于半衰期短(<30分钟)而需进行每日注射。为了延长hGH的血清半衰期，尝试了聚乙二醇的化学缀合(参见Clark et al.,(1996)J.Biol.Chem.271,21969-21977；Pradhananga et al.,2002J Mol Endocrinol.29,1114；Cho et al.,2011；Sondergaardet al.,(2011)J Clin Endocrinol Metabol.96,681-688)，和改性的hGH与人源化的CovX-主体IgG(CovX-Body IgG)的臂的化学缀合(参见Palanki et al.,(2013)Bioorg.Med.Chem.Lett.23,402-406)。此外，通过人类血清白蛋白(HSA)或包括几百个Pro-Ala-Ser(PAS)残基(PAS化(PASylation))的多肽序列的基因融合，成功延长了血清中的hGH的半衰期(参见Osborn et al.,2002Eur J Pharmacol.456,149-158；Anderson et al.,(2011)J Biol Chem.286,5234-5241；Sleep et al.,(2013)Biochimicaet B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对血清白蛋白(SA)的抗原结合片段(Fab)，其中，所述Fab包括：(a)重链可变区(VH结构域)，具有选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL结构域)，具有选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12组成的组中的氨基酸序列，其中，所述Fab特异性结合血清白蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.30 KR 10-2013-01041121.一种针对血清白蛋白(SA)的抗原结合片段(Fab)，其中，所述Fab包括：(a)重链可变区(VH结构域)，具有选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列；和(b)轻链可变区(VL结构域)，具有选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12组成的组中的氨基酸序列，其中，所述Fab特异性结合血清白蛋白。2.一种结合血清白蛋白(SA)的抗原结合片段(Fab)，其中，所述Fab包括：(a)决定VH结构域的CDR的SEQ ID NO.13(CDR1)、SEQ ID NO.14(CDR2)和SEQ ID NO.15(CDR15)的氨基酸序列；和(b)决定VL结构域的CDR的SEQ ID NO.16(CDR1)、SEQ ID NO.17(CDR2)和SEQ ID NO.18(CDR3)的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的Fab，其中，所述VH结构域与重链恒定区1(CH1结构域)相连，并且所述VL结构域与轻链恒定区(CκL结构域)相连。4.根据权利要求3所述的Fab，其中，所述VH结构域具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列，并且所述VL结构域具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的Fab，其中，所述CH1结构域和所述CκL结构域的半胱氨酸氨基酸缺失，或者被除了半胱氨酸之外的其它任意氨基酸残基取代，所述其它任意氨基酸残基包括丝氨酸。6.根据权利要求5所述的Fab，其中，CH1结构域的半胱氨酸氨基酸是从所述CH1结构域的N-末端起始的第233位氨基酸，并且CκL结构域的半胱氨酸是从所述CκL结构域的N-末端起始的第214位氨基酸。7.一种抗原结合片段(Fab)和生物活性效应物部分的融合构建体，其中，所述Fab的CH1结构域的半胱氨酸氨基酸和CκL结构域的半胱氨酸氨基酸缺失，或者被除了半胱氨酸之外的其它任意氨基酸残基取代，所述其它任意氨基酸残基包括丝氨酸；并且其中，所述生物活性效应物部分是蛋白或(多)肽；并且其中，所述Fab和所述生物活性效应物部分通过基因融合共价连接。8.一种根据权利要求1至6中任一项所述的抗原结合片段(Fab)与生物活性效应物部分的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分是蛋白或(多)肽；并且其中，所述Fab和所述生物活性效应物部分通过基因融合共价连接。9.根据权利要求7或8所述的融合构建体，其中，所述Fab和所述生物活性效应物部分使用0～20个氨基酸的肽接头，通过基因融合共价连接。10.根据权利要求7至9中任一项所述的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分是选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体组成的组中的一种。11.根据权利要求7至9中任一项所述的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分是选自由人类生长激素(hGH)、生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、集落刺激因子(CSF)、胰高血糖素样肽、G蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制子、转移生长因子、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段组成的组中的一种。12.根据权利要求11所述的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分是hGH、GCSF或IFN。13.根据权利要求7至12中任一项所述的融合构建体，其中，所述生物活性(多)肽(或蛋白)与Fab的摩尔比在1:1至10:1之间，优选在1:1至4:1之间。14.一种表达载体，包括：(a)启动子；(b)编码权利要求1至5中任一项所述的Fab的第一核酸序列；和(c)编码生物活性(多)肽或蛋白以及可选的接头的第二核酸序列，其中，所述启动子、所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被可操作地连接在一起。15.一种宿主细胞，包括权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：车相勋，
申请(专利权)人：艾普丽尔生物有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR