本发明专利技术提供了一种表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒及其应用。通过犬血清白蛋白全核苷酸序列与犬IFNγ成熟蛋白核苷酸序列相融合，构建重组杆状病毒筛选用重组质粒pF‑CSA‑IFNγ，筛选出稳定表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒。本方法构建的重组杆状病毒能够稳定分泌表达活性好，分离纯化简便的新型犬γ干扰素，为研制新型犬长效干扰素奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及突变或遗传工程
，具体是一种表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒及其应用。技术背景干扰素(Interferon，IFN)是由病毒或者其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。这种蛋白具有多种生物活性，包括抗增殖、免疫调节、抗病毒和诱导分化作用。根据特异性受体和序列同源性将干扰素分成I型和II型干扰素。IFN-γ是唯一的II型干扰素，也称为免疫干扰素。Young(1996)和Frucht(2001)提出，主要由CD4+Th1、CD8+细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞分泌，有些B细胞、NKT细胞和APC细胞也可分泌IFN-γ。Cantin(1999)提出，虽然I型和II型干扰素在对病毒早期细胞应答都很重要，但是IFN-γ在免疫应答后期起关键作用并且建立了抗病毒的长效控制机制。综合来看，I型干扰素起到的抗病毒活性作用要优于它的免疫调节作用，II型干扰素-IFN-γ则被认为免疫调节作用要强于抗病毒作用。同时Chin(1996)提出，IFN-γ抗肿瘤活性要比I型干扰素强很多，通过刺激巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞等先天免疫应答来发挥抗肿瘤作用，同时还可抑制肿瘤细胞的有丝分裂和增殖的作用。IFN-γ在抗病毒，抗肿瘤及免疫调节等方面发挥着重要作用，在临床有一定的应用价值。相对于人IFN-γ而言，动物IFN-γ的研究相对比较落后，基本停留在实验室的基因诱导与构建重组等阶段。尽管如此，郑仲金等(2007)研究表明IFN-γ作为疫苗佐剂或者治疗制剂表现出一定的效果。如对雏鸡急性新城疫、仔猪黄白痢、鸡传染性法氏囊等畜禽病毒性疾病效果明显；曹瑞兵等(2004)提出，猪重组IFN-γ能够对VSV起到有效的抗病毒作用；许金俊(2004)提出，重组奶牛IFN-γ对试验性大肠埃希菌引起的乳房炎具有较好的预防和控制效果；Schijns(2002)提出，重组猫IFN-γ能增强猫疫苗抗体的产生；龙小海等(1999)提出，重组鸡IFN-γ能明显抵抗球虫的作用；龙小海等(1999)提出，重组的犬IFN-γ能作为佐剂辅助性治疗病毒性肠炎、乙肝、病毒性感冒等。各研究都表明IFN-γ对动物体疾病的预防和控制具有良好的应用前景。而且畜禽感染致病菌后主要依赖疫苗和抗生素。但抗生素的残留及引起细菌的耐药性等因素影响人类和动物的健康，而疫苗只是针对特定病原产生长期保护。所以汤一苇(1996)提出，干扰素制剂不仅能提高抗体对抗原的免疫应答水平，而且能诱导机体选择性的调节免疫系统，因此被称为免疫激素的细胞因子正逐渐作为佐剂用于研制。随着干扰素类药物的广泛应用，其缺点不断暴露，半衰期短、稳定性差很大程度上限制干扰素的药用价值。长效干扰素的开发中采用了多种不同的方式，包括物理方法、化学方法和生物学方法。目前研究最为广泛的为生物学修饰法，其优势在于工业污染小、投入低、能够批量生产，并且有很大的优化改进空间。血清白蛋白融合技术是长效干扰素开发中最成熟的技术之一，Oborn(2002)首次采用人血清白蛋白制备融合干扰素蛋白，并以猴为试验动物，对其药效以及稳定性进行研究。目前该项技术已经在美国等国家被批准用于治疗丙型肝炎等慢性传染病。犬类作为伴侣动物在人类生活中扮演的角色越来越重要，宠物医疗保健水平的也不断提高，病毒性疾病严重影响犬类健康。而干扰素蛋白与血清白蛋白融合表达的研究主要集中于人医临床，目前国内外尚未见到针对犬IFN-γ的相关研究。我们通过基因融合技术，将犬IFN-γ基因与犬血清白蛋白基因相融合，利用昆虫细胞杆状病毒表达系统，成功表达了CSA-IFNγ蛋白，并对其生物活性性进行研究，为其在犬病毒性疾病的预防、免疫治疗及疫苗佐剂方面的应用奠定基础。现有技术存在以下技术问题：1.通过血清白蛋白与干扰素相融合来延长干扰素半衰期在人类医学研究较为深入，但兽医临床关于融合蛋白干扰素的研究及应用均比较少。目前临床上常用的犬免疫增强用干扰素为常规干扰素，多次反复注射会导致动物机体产生免疫耐受和其他不良反应，影响其治疗效果。2.兽用干扰素制品大都采用原核表达方式，产物多为包涵体形式，制备方法复杂。纯化过程中需要变性、复性等过程，产物生物活性较差，药物疗效一般。3.兽用干扰素制品在结构和功能上与天然蛋白差异大。4.兽用干扰素制品的高水平表达蛋白质占细胞总蛋白量低。5.兽用干扰素制品提纯困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是：1)提供一种表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的基因片段，与现有技术不同的是，可翻译为如SEQIDNO.1所示氨基酸序列，用于扩增其序列的上下游引物包含上游酶切位点EcoRI、上游酶切位点HindIII，具有如SEQIDNO.2所示的犬血清白蛋白核苷酸序列、柔性linker序列和犬IFNγ成熟蛋白核苷酸序列；2)提供一种利用所述的基因片段在构建表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的应用，与现有技术不同的是，本专利技术采用的载体质粒是pFastBacTMI，重组质粒是pF-CSA-IFNγ；3)提供一种表达犬用血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒及其应用，与现有技术不同的是，采用杆状病毒表达系统，表达出修饰合理、活性优、稳定性佳的犬血清白蛋白融合干扰素，为开发半衰期长、成本低、功效高的犬用血清白蛋白融合干扰素奠定基础；4)提供了一种表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒，与现有技术不同的是，可表达具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列，以及所述的表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒在制备增强免疫力药物中的应用，所述的免疫治疗药物为犬类免疫力增强的药物；5)提供了一种含有表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的增强免疫力药物和一种含有表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的犬类免疫力增强的药物。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术使用搭桥PCR技术，使基因的融合快捷方便，又可以避免酶切位点的引入干扰后续试验这个缺点；2.本专利技术采用杆状病毒表达系统，该系统与细菌、酵母和哺乳动物细胞表达体系相比具有如下优点：(1)重组蛋白具有完整的生物学功能，表达产物在结构及功能上更接近天然蛋白；(2)能够进行翻译后加工修饰，使表达产物在结构上最大限度接近于天然蛋白；(3)能够高水平表达蛋白质，可高水平获得重组蛋白，最高可达细胞总蛋白量的50％；(4)能够使表达产物通过分泌形式进行表达，进一步简化了分离纯化工作。与传统方法表达的犬干扰素相比较，本专利技术通过采用基因融合技术实现了犬血清白蛋白与犬γ干扰素的融合表达，且蛋白表达量高，活性好，为犬血清白蛋白融合干扰素的产品化创造了先决条件。犬γ干扰素具有抑制病毒复制、抗肿瘤、抗寄生虫及免疫调节等作用，作为一种重要的免疫增强剂，其在犬类病毒性疾病预防、免疫治疗及免疫佐剂方面应用前景广阔。附图说明：图1为犬血清白蛋白基因和犬γ基因PCR扩增图；图2为犬血清白蛋白基因与犬IFNγ基因PCR融合图；图3为pF-CSA-IFNγ重组质粒双酶切鉴定图；图4为携带Bacmid-CSA-IFNγ重组杆状病毒质粒菌株的筛选；图5为携带Bacmid-CSA-IFNγ重组杆状病毒质粒菌株的纯化；图6为CSA-IFNγ融合蛋白表达情况监测；图7为CS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的基因片段，其特征在于：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的基因片段，其特征在于：具有如SEQIDNO.1所示氨基酸序列。2.如权利要求1所述的基因片段，其特征在于：用于扩增其序列的上下游引物包含上游酶切位点EcoRI、下游酶切位点HindIII，具有如SEQIDNO.2所示的犬血清白蛋白核苷酸序列、柔性linker序列和犬IFNγ成熟蛋白核苷酸序列。3.权利要求1和2所述的基因片段在构建表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：采用的载体质粒是pFastBacTMI，重...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗满林，李冰，邹舒展，张贺，翟俊琼，周霞，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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