本发明专利技术涉及一种编码新型的具有D-丝氨酸合成活性的酶的DNA、该酶的制备方法、及利用该酶的D-丝氨酸制备方法。详细而言，涉及一种编码具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA、及将所述DNA整合到载体中形成的重组DNA、由所述重组DNA转化得到的转化体、及利用所述酶由甲醛和甘氨酸制备D-丝氨酸的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA、将该DNA整合到载体中形成的重组DNA、由该重组DNA转化得到的转化体、具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶及利用该酶由甲醛和甘氨酸制备D-丝氨酸的方法。
技术介绍
已知D-丝氨酸作为D-环丝氨酸等医药品的合成中间体是十分有用的化合物。目前，作为具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的酶，只公开了来自节杆菌(Arthrobacter) sp. DK-19的D-苏氨酸醛缩酶(以下，简称“DTA”)(参见特开昭58-116690号公报)。已有报道指出，使用甲醛及甘氨酸各50mmol，在30°C下利用所述DTA使其进行反应，40小时后D-丝氨酸的生成量为2. 5mmol (相对于甲醛的收率仅为5% )。针对于此，已有报道指出，来自同为节杆菌属微生物的节杆菌sp. DK-38的DTA，尽管具有对D-苏氨酸、D- β -羟基苯基丝氨酸、D- β -羟基-α -氨基戊酸等响应的广泛的底物特异性，但不对D-丝氨酸响应(参见Eur. J. Biochem.，1997，248，ρ385_393)。另外,有报道指出，通过使用来自黄单胞菌属(Xanthomonas)的DTA,能够由甘氨酸和醛类化合物制备D-β -羟基氨基酸类，但尚无使用来自黄单胞菌属的DTA由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的报道(参见特开平5-168484号公报)。
技术实现思路
鉴于上述
技术介绍
，本专利技术的目的在于，提供编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶的DNA、将该DNA整合到载体中形成的重组DNA、由该重组DNA转化得到的转化体、具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的新型酶、及利用该酶由甲醛和甘氨酸制备D-丝氨酸的方法。本专利技术人等认为在具有与公知的DTA类似的结构的未知酶中，可能存在具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的能力的酶，因此对与公知的DTA的氨基酸序列相关的信息进行了研究。其结果发现了与来自黄单胞菌属(GenBank登录号Ε05055)、无色杆菌(Achromobacter)属(GenBank 登录号 ΑΒ026892)、及节杆菌属(GenBank 登录号 ABO10956)的DTA的氨基酸序列相关的信息。比较上述氨基酸序列进行研究，结果发现，DTA的N末端区域及C末端区域的氨基酸序列具有高度的同源性。本专利技术人等以上述氨基酸序列中的N末端区域及C末端区域为基础设计引物，尝试使用此引物通过PCR扩增各种微生物的染色体DNA时，成功地扩增了来自无色杆菌属微生物、编码具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸的活性的酶的DNA。 与该DNA相当的氨基酸序列和公知的来自无色杆菌属的DTA的氨基酸序列的同源性约为50%左右，是与公知的来自无色杆菌属的DTA的氨基酸序列有很大差异的序列。另一方面，与公知的来自黄单胞菌属的DTA的氨基酸序列的同源性约为90%。之后本专利技术人等尝试使用由将上述新型DNA整合到载体中形成的重组DNA转化得到的重组大肠杆菌(Escherichia coli)使甲醒和甘氨酸反应合成D-丝氨酸时,令人1惊奇地发现，与现有公知的DTA不同，能够利用IOOmM甘氨酸和甲醛以反应收率在70%以上的高收率合成D-丝氨酸。此外，还确认了如果使用此重组大肠杆菌进行D-丝氨酸累积反应，会生成微量的L-丝氨酸。 D-丝氨酸用于医药中间体等要求高纯度的领域时，不希望在D-丝氨酸中混入L-丝氨酸。由于DL-丝氨酸的溶解度比D-丝氨酸的溶解度低，因此在制备D-丝氨酸时副生的L-丝氨酸会大幅度地降低D-丝氨酸的精制收率。为了解决此问题，本专利技术人等进行了更加深入的研究，结果发现，通过在2价金属离子存在的条件下实施有机溶剂处理及/或加热处理能够抑制L-丝氨酸的副生。另外，发现即使不进行上述处理，通过将反应中的甲醛浓度维持在150mM以上，也能够抑制L-丝氨酸的副生。并且发现，通过使用L-丝氨酸合成酶基因缺失的微生物作为生产用于D-丝氨酸合成的DSA的宿主，也能够抑制L-丝氨酸的副生。基于上述发现完成了本专利技术。即，本
技术实现思路
如下(I) 一种编码下述(a)或(b)的蛋白质的DNA，(a)蛋白质，含有序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列，(b)蛋白质，所述蛋白质含有在(a)氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性。(2)下述(a)或(b)的 DNA，(a)DNA,由序列表中序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列构成，(b) DNA,所述DNA与含有下述DNA序列的DNA片段在严格的条件下杂交，所述DNA序列为在序列表中序列号3、5、7中任一序列号记载的碱基序列或其互补序列中的至少20个连续碱基的序列，并且所述DNA编码具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶。(3) 一种将上述(I)或⑵所述的DNA整合到载体中形成的重组DNA。(4) 一种使用上述(3)所述的重组DNA转化宿主细胞得到的转化体。(5)如上述⑷所述的转化体，其中，被转化的宿主细胞为微生物。(6)如上述(5)所述的转化体，其中，被转化的微生物为D-丝氨酸脱氨酶缺失的微生物。(7)下述(a)或(b)的蛋白质，(a)蛋白质，含有序列号4、6、8中任一序列号记载的氨基酸序列，(b)蛋白质，所述蛋白质含有在(a)氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I个或多个氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性。(8) 一种制备具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶的方法，其特征在于，培养上述(4) (6)中任一项所述的转化体，从所得的培养物中获取具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的酶活性的蛋白质。(9) 一种D-丝氨酸的制备方法，其中，包含在上述(4) (6)中任一项所述的转化体或其处理物的存在下使甘氨酸和甲醛反应。(10) 一种D-丝氨酸的制备方法，其中，包含在上述(7)所述的蛋白质的存在下使甘氨酸和甲醛反应。(11) 一种D-丝氨酸的制备方法，所述制备方法在具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物或其处理物的存在下使甘氨酸和甲醛反应合成D-丝氨酸，其中，采用下述Q) Qv)中一种以上的方法，将在所述反应的反应液中副生的L-丝氨酸抑制在相对于D-丝氨酸为I. 5摩尔％以下， (i)对具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的微生物进行有机溶剂处理及/或加热处理的方法；(ii)将反应液中的甲醛浓度，在a)通过所述(i)的方法进行有机溶剂处理及/或加热处理时，控制在2M以下；在b)未进行有机溶剂处理及/或加热处理时，控制在150mM以上2M以下的方法；(iii)使用含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-丝氨酸的活性的酶、且L-丝氨酸合成酶基因缺失的微生物作为催化剂的方法；(iv)向反应液中添加含有具有L-丝氨酸脱氨酶活性的酶的微生物的方法。(12)如上述(11)所述的制备方法，其中，所述有机溶剂为选自甲醛、苯甲醛、二氯乙烷及异丙醇中的一种以上的有机溶剂。(13)如上述(11)或(12)所述的制备方法，其中，所述有机溶剂处理及/或加热处理在2价金属离子存在下进行。(14)如上述(13)所述的制备方法，其中，2价金属为选本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码下述(a)或(b)的蛋白质的DNA，(a)蛋白质，由序列号6、8中任一序列号记载的氨基酸序列构成，(b)蛋白质，由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列构成，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D？丝氨酸的酶活性。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：安乐城正，秀崎友则，渡边清一，西田圭太，长原清辉，小糸光男，
申请(专利权)人：三井化学株式会社，
类型：发明
国别省市：
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