一种利用宇佐美曲霉生产羧肽酶的方法技术

一种利用宇佐美曲霉生产羧肽酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术采用麸皮、豆饼粉和玉米粉等农副产品为发酵基料，通过适当改变培养基中碳源和氮源的比例，粗酶提取时间，利用宇佐美曲霉(Aspergillus?usamii)E001固态发酵生产羧肽酶。本发明专利技术提供了实验室小试生产的固态发酵培养基配方和培养条件，成熟发酵曲料的羧肽酶活性达到3452.4～5321.6U/g麸皮。本发明专利技术具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低廉、对环境友好以及羧肽酶活性较高等特点，有利于羧肽酶的开发和利用，具有较高的经济和实用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产羧肽酶的新方法，属于生物工程
具体而言是指使用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株固态发酵生产羧肽酶的新技术。
技术介绍
羧肽酶(Carboxyp印tidase)是一类肽链端水解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸，其在医药和食品工业领域有着广泛的应用。在医药领域，可用于重组人胰岛素的生产，肿瘤抗体导向酶的前药治疗，以及作为诊断急性胰腺炎轻重程度的血清标记等；在食品工业上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽链羧基端的疏水性氨基酸，达到脱苦的目的。另外，羧肽酶还可用于多肽的氨基酸测序。羧肽酶有小麦羧肽酶、动物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，动物来源的羧肽酶主要存在于猪和牛等的胰脏中，数量非常有限，价格昂贵，其应用因此而受到限制。而微生物来源的羧肽酶来源广泛，目前已在酵母和霉菌 (Aspergillus、Penicillium)中检测到羧肽酶的存在。因此，利用微生物发酵生产羧肽酶具有广阔的应用前景。曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要为丝氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性环境下，它们同时具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。亚夫尔在其专利技术专利(公开号CN95191058.2)中报道了编码黑曲霉羧肽酶的基因，其产生的羧肽酶存在于液泡中，可降解异源蛋白。Ichishima 等人分离得到的一株黑曲霉液体发酵生产羧肽酶，酶活为360 mU/mL滤液。Krishnan等人用清酒曲培养基固体发酵培养黑曲霉产羧肽酶酶活为60. 5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖琼脂培养基固体发酵生产羧肽酶0，酶活为463. Omkat/kg。综上所述，羧肽酶广泛存在于曲霉中，但目前无论是液态发酵或固态发酵，微生物产羧肽酶活力均较低，导致了羧肽酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用。羧肽酶属于次级代谢产物，霉菌的次级代谢产物通常是在霉菌进行分化时形成的，液态培养抑制真菌分化，所以真菌固态发酵单位体积的酶产量往往比液态发酵高。羧肽酶的产生量受碳源氮源及无机离子影响，通过改变发酵过程中的培养基组分可逐步提高产酶量。本专利中利用宇佐美曲霉EOOl菌株固态发酵生产羧肽酶为丝氨酸羧肽酶，可用作氨基酸测序，食品工业的脱苦剂等，其固态发酵产量最高可达5321. 6U/g麸曲。微生物固态发酵具有设备简单、投入少、见效快、生产成本低以及对环境友好等优势。本专利技术利用宇佐美曲霉固态发酵生产羧肽酶的酶活性高于国内水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以麸皮、玉米粉和豆饼粉等农副产品为发酵基料，利用宇佐美曲霉EOOl固态发酵生产羧肽酶的方法。本专利技术所述固态发酵的技术方案和内容如下1、菌株宇佐美曲霉(Aspergillus niger)E001,由江南大学筛选和保藏。该菌种已经于2008年在《生物加工过程杂志》杂志的Vol. 6 No. 2 Pg. 38公开。2、斜面种子培养；去皮马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH;121°C灭菌20min，放置斜面；冷却后接种EOOl菌株，30°C培养96h。此斜面培养基可用于菌种的活化、保藏和斜面种子等。每3个月转接1次。3、麸曲种子的制备:250mL三角瓶中装IOg基料(即麸皮IOg)，(NH4)2SO4O. Ig,自来水12mL，自然pH，充分混勻。121°C灭菌40min，冷却后接种EOOl试管斜面种子，30°C培养 96h，期间分别于20h和44h各翻曲一次。4、固态发酵250mL三角瓶中装IOg基料(麸皮8 10g，豆饼粉1 2g，玉米粉 0 Ig)，(NH4) 2S0450 IOOmg, MgS045 IOmg, CaCl25 IOmg, KH2P0430 50mg,自来水 12 15mL，自然pH。121°C灭菌40min，冷却后接种EOOl斜面种子，30°C培养84 96h，期间分别于20 24h和44 48h各翻曲一次。5、粗酶液提取固态发酵结束后取培养物lg，每个锥形瓶中加入100mL50mM柠檬酸钠缓冲液(PH5. 0)，碾磨lOmin，静置一段时间后过滤，离心、4000rpm、IOmin)后得到的上清液即为粗酶液。测定时经缓冲液稀释适当倍数。6、分析方法酪氨酸标准曲线的制作分别取2mmol/L的标准酪氨酸溶液0，0. 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. OmL于试管中，用水补足至2mL。再加入ImL茚三酮显色液，充分混勻后，盖住试管口，在100°C水浴中加热15min， 用自来水冷却。放置5min后，用分光光度计测定570nm处吸光度值(OD57tlIim)。以0D57(1nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。茚三酮法测羧肽酶酶活将0. 05mmol Z-Phe-Tyr试剂溶于20mL 50mM醋酸钠缓冲液(pH3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL离心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保温20min，加入0. 2mL 0. 3MNa0H终止反应。从酶底物反应液中量取50 μ L，再加入950 μ L 蒸馏水，得到1. OmL的稀释后样品，按照标准曲线方法测定。产物浓度通过标准曲线计算。 酶活单位定义为每分钟产生1 μ g酪氨酸所需的酶量。本专利技术的有益效果本专利技术的突出优点是采用廉价的麸皮、豆饼粉和玉米粉等农副产品为发酵主原料，是一种充分利用自然界可再生资源的生产方式。同时，利用宇佐美曲霉菌株固态发酵法生产羧肽酶，符合生态系统中的自然法则，是一种绿色环保且可持续的生产方式，且具有设备简单、投资少、生产成本低等优势。本专利技术利用宇佐美曲霉EOOl菌株，采用固态发酵生产羧肽酶，实验室小试产羧肽酶活性最高可达5321. 6U/g麸曲。具体实施方法下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细说明，但不应将此理解为本专利技术上述内容的范围仅局限于下述实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。实施例11.菌株宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001 菌株。2.固态发酵培养基250mL三角瓶中装IOg发酵基料(即麸皮IOg)， (NH4) 2S0450mg, MgS045mg, CaCl2IOmg, KH2P0430mg,自来水 13mL,自然 pH。3.固态发酵条件121°C灭菌40min，冷却后接种一菌耳EOOl麸曲种子，30°C静置培养96h，期间分别于24h和4 各翻曲一次。4.粗酶液提取固态发酵结束后取培养物lg，每个锥形瓶中加入IOmL 50mM柠檬酸钠缓冲液 (pH5. 0)，碾磨lOmin，静止30min后过滤，离心(4°C >4000rpmU0min)后得到的上清液即为粗酶液。5.茚三酮反应将0. 05mmolZ-Phe-Tyr溶于20mL 50mM醋酸钠缓冲液(pH3. 0)作底物，定量移取1. 8mL底物(Z-Phe-Tyr，2. 5mmol/L)溶液于5mL离心管中，再加入酶液0. 2mL, 30°C保温 20min，调pH 6. O终止反应。从酶底物反应液中量取500 μ L，再加入500 μ L蒸馏水，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种小试生产羧肽酶的方法，其特征是以麸皮、豆饼粉和菜籽饼粉为固态发酵培养基的基料，并添加适量的无机盐营养液，在２５０ｍＬ三角瓶中，利用宇佐美曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｕｓａｍｉｉ）Ｅ００１菌株固态发酵生产羧肽酶。

【技术特征摘要】
1.一种小试生产羧肽酶的方法，其特征是以麸皮、豆饼粉和菜籽饼粉为固态发酵培养基的基料，并添加适量的无机盐营养液，在250mL三角瓶中，利用宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株固态发酵生产羧肽酶。2.如权利要求1所述生产羧肽酶的方法，其特征在于使用的菌种是宇佐美曲霉。3.如权利要求1所述生产羧肽酶的方法，其特征在于采用的发酵工艺是固态发酵。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用的固态发酵培养基配方为250m...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，闵柔，邬敏辰，李剑芳，陈伟，唐存多，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32