本发明专利技术提供了一种来自冬虫夏草中国被毛孢参与水解大分子蛋白质生成小分子蛋白质的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。所述丝氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术从原理上对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的过程进行了详细研究，提供了“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢参与侵染机制机理的丝氨酸蛋白酶及其编码基因，本发明专利技术所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用来通过转导、转化、结合转移的方法转入工程菌中，通过调节蛋白水解酶基因的表达，赋予宿主丝氨酸蛋白酶的高表达性，为扩大丝氨酸蛋白酶的生物应用提供了有效途径，具有重大应用前景。
【技术实现步骤摘要】
来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用(一)
本专利技术涉及来自“百令”生产菌冬虫夏草中国被毛孢的丝氨酸蛋白酶、编码基因及其应用。(二)
技术介绍
冬虫夏草(Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(HepialusarmoricanusOberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草以其多种药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。但是，对冬虫夏草中国被毛孢机制机理的研究几乎为空白，尤其在中国被毛孢侵染蝙蝠蛾幼虫的机制机理上，以及对丝氨酸蛋白酶在中国被毛孢侵染机制中的作用的研究。丝氨酸蛋白酶广泛存在于动物、植物、细菌、病毒、真菌中，并且参与生命的各种反应，比如蛋白质翻译后后加工、细胞分裂、病原体感染、组织降解、细胞凋亡等，可见丝氨酸蛋白酶具有广泛的研究和应用价值。丝氨酸蛋白酶是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶，在生物有机体中起着重要而广泛的生理作用，还在胚胎发育、组织重建、细胞分化、血管形成和病原侵入等过程中都发挥着重要的作用。丝氨酸蛋白酶超家族的成员多而广，它们的活性部位都含Ser、His、Asp，并具有相同的催化机制，但是它们与底物结合部位的差异决定了各自对底物的专一性。丝氨酸蛋白酶在结构上为全β蛋白，核心结构由两个非常相似的结构域(N结构域和C结构域)构成。由于两个结构域在结构上存在着差异，它们在功能和进化上的作用也就不同。1986年，GershenfeldHK等人在《Science》上发表论文，他们通过RNA杂交竞争协议从小鼠的细胞毒性T淋巴细胞互补DNA文库中分离出的克隆可以编码一个新的丝氨酸蛋白酶，并且对它进行了克隆，该基因的碱基序列编码约为25700道尔顿的氨基酸序列，25％至35％属于丝氨酸蛋白酶家族，保守的活性位点残基为His57，Asp102和Ser195的胰凝乳蛋白酶。Southern杂交分析表明，这个基因在人类，小鼠和鸡种保守。此丝氨酸蛋白酶可能在淋巴细胞的裂解和溶解级联有作用。1999年，KyokoYamashiroa等人从人结肠腺癌细胞中克隆到了一个新的丝氨酸蛋白酶，该序列包括155bp的5’非编码区和一个位于551bp的3’非编码区后的732bp长的开放阅读框非编码区，预测的蛋白由244个氨基酸组成，和丝氨酸蛋白酶家族的其他成员显示一定的相似性，和发现的其他类似胰蛋白酶一样，这种酶含有作为必要的氨基酸残基的活性的催化三联体。2003年，李文辉等人利用逆转录酶与聚合酶链反应相结合的RT-PCR法，扩增出5个竹叶青(Trimeresurusstejnegeri)蛇毒丝氨酸蛋白酶的cDNAs，将扩增的cDNA片段克隆入pGEM-T载体中，再经末端终止法测定核苷酸序列，推导出5个丝氨酸蛋白酶的全序列。5个丝氨酸蛋白酶分别含有1-6个N-型糖基结合位点，表明它们的计算分子量与纯化蛋白表观分子量之间的差异是由糖含量的不同造成，而其氨基酸序列相似度在60％-90％。2004年，储卫华等人根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。2005年，李江等人从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株(Streptomycesfradiaevar.k11)中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序，得到部分氨基酸序列，设计简并引物，PCR扩增得到部分基因序列，通过构建基因文库，获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2(EMBL收录号AJ784940)，开放阅读框全长924bp，包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列，其中成熟蛋白编码基因长576bp，编码191个氨基酸，理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达，酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性，证明了克隆基因的生物学功能。2008年，雷迎峰等人在大肠杆菌中进行了HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶的表达并进行纯化。根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求，通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因。合成相应引物，利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因，克隆入原核表达载体pRSET-A，将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL21(DE3)大肠杆菌，并诱导表达与纯化。成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a，重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后，表达产物经SDS-PAGE和Western-blot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶，并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶。获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础。2011年，王俊伟等人根据已经报道的少孢节丛孢菌丝氨酸蛋白酶基因序列，设计特异性引物，通过PCR技术对少孢节丛孢菌新疆分离株(XJ-XA)丝氨酸蛋白酶(命名为Aoz1)基因序列进行了扩增，并与国内外少孢节丛孢菌不同地域分离株相应序列进行了同源性分析，构建该基因系统进化树。结果显示，XJ-XAAoz1基因全长为1344bp，包含2个外显子和1个63bp的内含子(第517～579位核苷酸)，编码426个氨基酸。系统发生分析发现，少孢节丛孢菌不同地域分离株Aoz1基因序列具有较高的亲缘性，与其他捕食线虫性真菌Aoz1基因亲缘性较远。此项研究为研发家畜线虫病生物防控制剂奠定了前期基础。2012年，刘海明等人利用粉纹夜蛾Trichoplusiani围食膜蛋白多克隆抗体筛选华北大黑鳃金龟Holotrichiaoblita中肠cDNA表达文库，首次得到编码华北大黑鳃金龟丝氨酸蛋白酶cDNA序列，命名为HoSP1(GenBank登录号为FJ573146)。序列分析表明，该基因长9本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种来自冬虫夏草的丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述丝氨酸蛋白酶氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.如权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶在生物催化酪素制备酪氨酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含丝氨酸蛋白酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体用pH8.0磷酸盐缓冲液悬浮，超声破碎后，取破碎混合液离心，取上清液作为催化剂，以10.00mg/mL酪素溶液为底物，40℃下水浴反应，反应结束后，将反应液离心，取上清液即获得含酪氨酸的混合液；所述10.00mg/mL酪素溶液按如下步骤制备：取1.000g酪素用0.5mol/L的氢氧化钠水溶液润湿，加入pH值为8.0的PBS缓冲液，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度；所述氢氧化钠水溶液的体积用量以酪素质量计为5ml/g。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述底物的用量以酪素质量计，所述酪素的初始浓度为5mg/mL，所述催化剂的体积用量以破碎前湿菌体的质量计，终浓度为20g/L。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，郑裕国，林善，薛亚平，吴晖，李邦良，许静，许峰，王鸿艳，
申请(专利权)人：浙江工业大学，杭州中美华东制药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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