一种绿盲蝽丝氨酸蛋白酶AlSP4、其多克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种绿盲蝽丝氨酸蛋白酶(Apolygus lucorum serine proteases，AlSP4)、其多克隆抗体及其制备方法和应用。本发明专利技术将通过原核表达纯化技术，体外重组表达丝氨酸蛋白酶AlSP4蛋白，继而将重组蛋白应用于新西兰大白兔后制备了多克隆抗体，并利用ELISA法确定该多克隆抗体效价后，发明专利技术人采用Western blot法确定该多克隆抗体能特异性识别AlSP4重组蛋白可产生特异性免疫反应。基于此，发明专利技术人还建立了一套高效的Western blot方法，可特异性地从绿盲蝽虫体内检测出AlSP4蛋白。应用本发明专利技术，可为丝氨酸蛋白酶在绿盲蝽虫体内组织分布、虫体外重组表达以及该类蛋白的蛋白表达量快速检测等分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农业科学
，具体涉及一种绿盲蝽丝氨酸蛋白酶AlSP4、其多克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
绿盲蝽Apolyguslucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、果树、蔬菜、苜蓿等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于Bt棉的大面积推广和农业产业结构调整等原因，绿盲蝽种群数量急剧上升，加之长期主要依赖化学农药防治，势必会加速绿盲蝽抗药性的上升，导致目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。绿盲蝽寄主众多、食性杂，而不同寄主植物包含的营养物质具有很大差别，害虫体内消化酶活性强弱与摄入营养的类型和含量有关，可以反映害虫对寄主植物营养消化的能力，进而影响害虫本身的生长速度。因此，明确并抑制绿盲蝽取食特定寄主后特异性消化酶的种类及活性对于发掘绿盲蝽新型防控措施具有重要意义。在昆虫众多消化酶中，丝氨酸蛋白酶是其消化系统内重要的消化酶，包括弹性蛋白酶、类胰蛋白酶及类胰凝乳蛋白酶等。绿盲蝽AlSP4基因在其取食不同寄主后，基因表达量呈现显著差异，尤其针对Bt棉。而在昆虫体内实际行使功能的不是酶基因而是酶蛋白。因此，急需灵敏度高，特异性好的蛋白检测技术来分析绿盲蝽寄主转换过程中AlSP4酶蛋白的表达量，从而探寻天然植物源的AlSP4酶蛋白抑制，进而探索绿盲蝽的新型防控技术。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的第一个目的是提供一种重组表达载体。本专利技术的另一个目的是提供一种转基因重组菌。本专利技术的又一个目的在于提供一种绿盲蝽AlSP4蛋白的制备方法。本专利技术的又一个目的是提供一种绿盲蝽AlSP4蛋白多克隆抗体。本专利技术的又一个目的在于提供一种绿盲蝽AlSP4蛋白多克隆抗体的制备方法。本专利技术的又一个目的是提供一种绿盲蝽AlSP4蛋白多克隆抗体的表达量特异性Westernblot检测方法。技术方案：本专利技术中采用的AlSP4基因全长、预测蛋白的序列号在NCBI(NationalCenterofBiotechnologyInformation)上的登录号为JQ609682。为了解决上述问题，本专利技术的技术方案是提供一种重组表达载体，含有用于编码绿盲蝽AlSP4蛋白的DNA序列。进一步地，将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽AlSP4蛋白的重组表达载体。进一步地，所述大肠杆菌表达载体为pSUMO-Mut。一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。进一步地，所述的大肠杆菌为ArcticExpress。一种绿盲蝽AlSP4蛋白的制备方法，包括以下步骤：1)、编码绿盲蝽AlSP4开放阅读框cDNA双链的PCR扩增；2)、绿盲蝽AlSP4蛋白的原核表达载体构建；3)、HIS-Tag标签抗体的Western-blot验证；4)、绿盲蝽AlSP4蛋白的变性与复性；5)、绿盲蝽AlSP4蛋白的分离、纯化即得到重组的绿盲蝽AlSP4蛋白。一种绿盲蝽AlSP4蛋白多克隆抗体，将得到的重组的绿盲蝽AlSP4蛋白免疫新西兰大白兔后制得。一种绿盲蝽AlSP4蛋白多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：1)、将重组的绿盲蝽AlSP4蛋白免疫新西兰大白兔；2)、抗原亲和纯化法获得针对AlSP4蛋白的多克隆抗体；3)、AlSP4蛋白的多克隆抗体效价的ELLSA检测。一种绿盲蝽AlSP4蛋白多克隆抗体的表达量特异性Westernblot检测方法，包括以下步骤：1)、取2日龄绿盲蝽成虫提取的总蛋白及体外重组表达纯化的AlSP4蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、洗膜、封闭。2)、用封闭液稀释一抗(本专利技术制作的AlSP4蛋白多克隆抗体)，膜在一抗稀释液中反应，洗膜，封闭液稀释羊抗兔的酶标二抗，膜在二抗中反应，化学发光显影。有益效果：本专利技术相对于现有技术，具有以下优点：将原核表达纯化的AlSP4重组蛋白应用于免疫新西兰大白兔后制备了多克隆抗体，在通过利用ELISA法确定了该多克隆抗体的效价后，专利技术人采用Westernblot法发现该多克隆抗体能特异性识别原核表达纯化的AlSP4重组蛋白，可产生特异性免疫反应。基于此，专利技术人还建立了一套高效、高灵敏度和准确的Westernblot方法，可特异性地从绿盲蝽虫体内检测出AlSP4蛋白。应用本专利技术，可为丝氨酸蛋白酶类酶蛋白在绿盲蝽体内的组织分布以及该蛋白的快速检测和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑。此外，与常规表达载体(如PET28a)及大肠杆菌(如BL21)搭配组合表达AlSP4蛋白较少，蛋白电泳几乎没有条带相比，本专利技术利用pSUMO-Mut表达载体合理搭配ArcticExpress菌的方法却可以大量体外重组表达绿盲蝽消化酶AlSP4蛋白，并为进一步系统研究绿盲蝽分子消化机制提供了坚实的研究基础。附图说明图1：AlSP4基因开放阅读框及构建双酶切位点PCR扩增电泳图；泳道1：为2000bp的DNAmaker；泳道2：AlSP4基因开放阅读框；泳道2：AlSP4基因开放阅读框两端分别加上StuI及HindIII酶切位点后的PCR图谱；图2pSUMO-Mut-AlSP4利用IPTG诱导表达经10％SDS-PAGE分析电泳图；泳道M：为蛋白maker；泳道1：未经诱导菌株的总蛋白；泳道2：空载体诱导菌株的总蛋白；泳道3：经0.5mMIPTG在37℃诱导靶标载体表达的总蛋白上清液；泳道4：经0.5mMIPTG在37℃诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；图3：AlSP4蛋白重组表达后的HIS-Tag标签抗体Western杂交验证图；M：为100kd蛋白maker；泳道1：为未经IPTG诱导的菌株样品；泳道2：空载体对照(pSUMO-Mut)；泳道3：为经IPTG诱导的菌株样品上清；泳道4：为经IPTG诱导的菌株样品包涵体；图4：AlSP4蛋白诱导表达，纯化后经10％SDS-PAGE电泳分析图谱；泳道M：为蛋白maker；泳道1：经0.5mMIPTG在不同温度条件下诱导靶标载体表达的总蛋白包涵体；泳道2：纯化后的AlSP4靶标蛋白；图5：AlSP4蛋白特异性抗体纯化、电泳分离后，考马斯亮蓝染色图谱；图6：利用AlSP4蛋白特异性肽链抗体Western杂交图谱；M：为200kd蛋白maker；内参：为同一张膜β-actin蛋白Western杂交图谱；泳道1：2日龄绿盲蝽成虫组织内AlSP4蛋白Western杂交图谱；泳道2：含本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组表达载体，其特征在于，含有用于编码绿盲蝽AlSP4蛋白的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，其特征在于，含有用于编码绿盲蝽AlSP4蛋白的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽AlSP4蛋白的重组表达载体。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为pSUMO-Mut。
4.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求3所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。
5.根据权利要求4所述的转基因重组菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为ArcticExpress。
6.一种绿盲蝽AlSP4蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、编码绿盲蝽AlSP4开放阅读框cDNA双链的PCR扩增；
2）、绿盲蝽AlSP4蛋白的原核表达载体构建；
3）、HIS-Tag标签抗体的Western-blot验证；
4）、绿盲蝽AlSP4蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙洋，赵静，谭永安，肖留斌，柏立新，戴瀚洋，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32