本发明专利技术公开了一种抗/耐草甘膦基因及其应用。该抗/耐草甘膦基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1、SEQIDNO：3或SEQIDNO：5及其编码的氨基酸序列分别为SEQIDNO：2、SEQIDNO：4或SEQIDNO：6。利用该来自于植物的抗/耐草甘膦基因制备抗/耐草甘膦植株，可以明显的显示出抗/耐草甘膦除草剂，这为培育抗/耐草甘膦除草剂作物提供了新的选择，增加抗/耐草甘膦除草剂转基因技术的多样性，从而降低了抗/耐除草剂转基因技术的生态风险。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本专利技术涉及三种植物源抗/耐草甘膦基因以及该基因编码的蛋白质。通过遗传转化的方法使该基因在植物中表达而使植物获得对草甘膦的抗性能力，从而可以利用草甘膦于作物田间选择性地防除杂草。本专利技术也可以运用在作物育种、植物细胞培养的筛选。
技术介绍
草甘膦(glyphosate)分子式为C3H8NO5P，是一种高效、广谱、低毒、低残留、不破坏土壤环境、对大多数植物具有灭生性的除草剂。具有对人畜无毒，自然条件下杂草和农作物对它产生抗性的频率较低，低土壤残留量等特点，市场潜力巨大。 草甘膦毒性作用机理主要是竟争性抑制EPSP合酶即5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)，该酶广泛存在于真菌、细菌、藻类、高等植物体内，但不存在于动物体内。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似物，二者的分子式极为相似，它能与PEP竞争性结合EPSP合酶，形成EPSP合酶· 3-磷酸莽草酸(S3P) ·草甘膦的复合物，阻断EPSP的合成，从而阻断芳香族氨基酸的合成，导致植物死亡。然而草甘膦无选择性地杀死作物和杂草，限制了它在农业生产上的使用，因此为了能够在农作物生长期间应用草甘膦选择性地除草，农作物需要获得具有抗/耐草甘膦的能力。尽管草甘膦能抑制大部分植物和细菌中芳香族氨基酸合成过程中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)，但已发现部分细菌的EPSPS对草甘膦不敏感，被分离出来，生产实践中也发现有些植物具有对草甘膦的耐药性。通过转基因表达细菌或有草甘膦抗性植物的EPSPS基因而获得抗/耐草甘膦的能力。农杆菌CP4和SalmonellatyphimuriumCYl的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中应用(美国专利453590，4769061,5094945)。抗草甘勝putida^Zymomonas mobilis ^XJiiKlebsiellapneumoniae等EPSPS基因也申请了专利保护。在植物中也发现了由于EPSP合酶单个氨基酸位点突变造成其对草甘膦具有抗药性。马来西亚的牛筋草、澳大利亚的瑞士黑麦草和智利的多花黑麦草对草甘膦的抗药性即是草甘膦靶标酶EPSPS基因106位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸或苏氨酸所致(Powles，2006)。抗草甘膦牛筋草EPSPS的编码基因发生了变化，牛筋草敏感生物型EPSPS基因的第319个核苷酸碱基为胞嘧啶C，而抗性生物型中突变成了胸腺喃唳T,使第106位脯氨酸变为了丝氨酸(Baerson et al.，2002)。Ng等发现抗性生物型中同时存在胞嘧啶C突变成了鸟嘌呤A，导致其第106位脯氨酸变为苏氨酸(NG etal, 2003)。另外还有多个位点的甘氨酸被天门冬氨酸、苏氨酸被丙氨酸、脯氨酸被亮氨酸取代的例子，说明EPSPS存在多个与PEP结合的活性位点。通过这些有效位点的基因突变，降低了 EPSPS对草甘膦的亲和性，从而增强了杂草对草甘膦的抗性。孟山都公司已经对抗草甘膦牛筋草的EPSPS基因申请了专利保护。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗/耐草甘膦基因和以此为基础的抗/耐草甘膦植物。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种基于自然界的植物天然耐性为基础，经过前期对大量植物进行的草甘膦耐性筛选得到的新的抗/耐草甘膦基因。为了达到上述目的，本专利技术提供了三种具有草甘膦耐性的基因(LsEPSPS)LsEPSPSU LsEPSPS2 和 LsEPSPS3，核苷酸序列分别为 SEQ ID NO U SEQ ID NO :3 和 SEQID NO :5。利用上述LsEPSPSl、LsEPSPS2和LsEPSPS3三种核酸序列，可以用来人工引入一个或多个变异，然后通过草甘膦筛选变异分子，而获得保持有抗/耐草甘膦能力的变异分子。例如利用低保真PCR的方法可以产生很多LsEPSPSl、LsEPSPS2和LsEPSPS3的变异分子，而 这些变异分子可以通过草甘膦筛选获得继续保持有抗/耐草甘膦能力的变异分子。本专利技术还提供了一种抗/耐草甘膦蛋白质多肽，该抗/耐草甘膦蛋白质多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6或与上述氨基酸序列相比具有不小84%相同性的氨基酸序列。本专利技术还提供了核苷酸序列为编码上述蛋白质多肽的基因，该基因与LsEPSPSl、LsEPSPS2、LsEPSPS3和上述得到的保持有抗/耐草甘膦能力的变异分子统称为抗/耐草甘膦基因(LsEPSPS)。本专利技术还提供了一种能够与上述蛋白质多肽结合的抗体。SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :6 分别表示为 SEQ ID NO USEQ ID NO:3和SEQ ID NO :5编码的氨基酸序列。这三种氨基酸序列均包含四个特异性位点，麦冬中为144m, 184i, 232a以及273m，土麦冬和阔叶土麦冬中为146m, 186i, 234a以及275m，相当于大肠杆菌EPSP合酶氨基酸序列中70、107、153以及192位。氨基酸序列SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 6表示的蛋白质多肽包括信号肽和成熟蛋白两部分。氨基酸序列同源性相当高的蛋白质一般具有相同的功能，因此与SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6相比具有84%相同性的氨基酸序列都可能对草甘膦有抗性。利用本专利技术的基因编码的氨基酸序列，可以设计和人工合成密码子优化的有利于在植物中表达的核酸序列。例如 Campbell 和 Gowri (1990)的报道(Plant Physiology, 92:1-11)。本专利技术还提供了一种包含抗/耐草甘膦基因的表达载体，所述表达载体为原核表达载体或植物转化质粒。构建包含表达构件的原核表达载体时，表达构件包括启动子和抗/耐草甘膦基因，载体质粒可以是PET系列、pMAL - p2X或pRSET_A等。在原核生物表达系统中，启动子可以是T7噬菌体启动子或者Iac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR( λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac (乳糖和色氨酸的杂合启动子)等强启动子。利用抗/耐草甘膦基因进一步构建包含表达构件的植物转化质粒时，表达构件包括启动子，带有叶绿体信号肽的抗/耐草甘膦基因和终止子。在转化单子叶植物时启动子可以是玉米Ubiqutin启动子,或者水稻Actin启动子,或者其他启动子。而终止子可以是根据根癌农杆菌终止子或者其他终止子。抗/耐草甘膦的LsEPSPS基因在5’端连接一个在同一个表达阅读框内表达的编码信号肽的DNA片段，这个信号肽可以引导LsEPSPS蛋白质进入叶绿体。这个信号肽可以是Rubisco的亚基的信号肽(de castro Silva Filho1996 Plant Mol . Biol . 30 : 767 一 780 )，或者植物 EPSPS 信号肽(Archer 1990 J Bioenerg. Biomemb . 22 ( b ) : 789 — 8 10 )，或者其他能使 EPSPS 发挥本文档来自技高网...
【技术保护点】
植物抗/耐草甘膦基因，该抗/耐草甘膦基因的核苷酸序列为SEQ？ID？NO：1、SEQ？ID？NO：3或SEQ？ID？NO：5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：强胜，毛婵娟，陈世国，戴伟民，宋小玲，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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