【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种由两个嗜酸性内切葡聚糖酶和一个嗜酸性内切木聚糖酶构成的多酶组合及其编码基因和应用。
技术介绍
0、技术背景
1、植物残体是自然界中储量极其丰富的可再生资源，其主要成分包括纤维素和木聚糖。纤维素由d-葡萄糖残基通过β-1,4-糖苷键串联形成长链分子，并以结晶结构形式大量存在；木聚糖则由d-木糖残基通过β-1,4-糖苷键串联形成，是继纤维素之外储量最丰富的多聚糖物质。自然界中，微生物能够分泌包括内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶等对植物残体中复杂纤维素和木聚糖成分进行高效水解，从而发挥长链断裂和释放寡糖的作用。因此，内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶等多聚糖(纤维素和木聚糖)水解酶被广泛应用于工业的各个领域，包括造纸、纺织、生物能源、饲料、食品等。
2、随着工业的不断发展，对极端环境下依然能够高效发挥酶解作用的纤维素酶和木聚糖酶产品需求迫切。例如，生物能源领域中植物残体预处理的酸性环境、果汁澄清处理的酸性环境、动物饲料的胃酸环境等急需耐酸或嗜酸性纤维素酶和木聚糖酶在低ph值环境下(ph 2-4)高效水解纤维素和木聚糖促进糖化、澄清以及消化等关键过程。除此之外，农业微生物肥料制造领域通常采用酸处理植物残体在低ph值(3.0左右)条件下发酵制备木霉功能菌孢子产品，然而在此环境下大部分多聚糖水解酶活性低下。因此，发掘能够在酸性环境下(ph 2-4)高效发挥水解作用且具有优异酸稳定性特征的内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶能够满足不同领域的工业应用需求。
技术实现思路>
1、本专利技术目的是针对不同领域对酸性条件下(ph<4)高效发挥酶解作用且稳定的内切葡聚糖酶和内切木聚糖酶的迫切需求，而常规酶在此条件下结构不稳定、易失活的现状，提供一种包括两个嗜酸性内切纤维素酶基因和一个嗜酸性内切木聚糖酶基因的多酶组合。
2、本专利技术的另一目的是提供表达所述三个基因的基因工程菌。
3、本专利技术的又一目的是提供所述三个基因的应用。利用所述三个基因生产的多酶制剂可用于果汁澄清、动物饲料、微生物有机肥的木霉孢子制备等领域，满足低ph值条件下稳定且高效发挥水解作用的需求，带来可观的经济效益。
4、本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：
5、一种嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1，其核苷酸序列为seq id no.1。该基因的全长(包含起始密码子和终止密码子)为663bp，g+c含量为49％，编码由219个氨基酸组成的嗜酸性内切葡聚糖酶egl1，其氨基酸序列为seq id no.2。
6、一种嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2，其核苷酸序列为seq id no.3。该基因的全长(包含起始密码子和终止密码子)为1200bp，g+c含量为49％，编码由399个氨基酸组成的嗜酸性内切葡聚糖酶egl2，其氨基酸序列为seq id no.4。
7、一种嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1，其核苷酸序列为seq id no.5。该基因的全长(包含起始密码子和终止密码子)为750bp，g+c含量为54％，编码由249个氨基酸组成的嗜酸性内切葡聚糖酶xyn1，其氨基酸序列为seq id no.6。
8、第一方面，本专利技术保护一种酶组合，所述酶组合由嗜酸性内切葡聚糖酶egl1、嗜酸性内切葡聚糖酶egl2以及嗜酸性内切木聚糖酶xyn1组成；所述嗜酸性内切葡聚糖酶egl1的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述嗜酸性内切葡聚糖酶egl2如seq id no.4所示，所述嗜酸性内切木聚糖酶xyn1如seq id no.6所示。
9、第二方面，本专利技术保护一种与前文所述酶组合相关的基因组合，所述基因组合包括编码嗜酸性内切葡聚糖酶egl1的基因egl1、编码嗜酸性内切葡聚糖酶egl2的基因egl2以及编码嗜酸性内切木聚糖酶xyn1的基因xyn1组成；所述基因egl1的如核苷酸序列为seq idno.1所示；所述基因egl2如核苷酸序列seq id no.3所示；所述基因xyn1的如核苷酸序列seq id no.5所示。
10、第三方面，本专利技术保护一种与前文所述基因相关的重组载体组合，所述重组载体组合包括含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1的重组载体、含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2的重组载体以及含有嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的重组载体。
11、在具体的实施方案中，所述重组载体为重组质粒。
12、在更具体的实施方案中，本专利技术公开了三种重组质粒，分别为含有上述嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1的ppiczαa-egl1，嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2的ppiczαa-egl2，以及嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的ppiczαa-xyn1。均是通过ecori和xbai双酶切法分别将egl1、egl2和xyn1基因cdna序列插入ppiczαa表达质粒的多克隆位点处并融入质粒正确表达框中，通过博来霉素(zeocin)筛选正确突变子并测序验证获得。
13、第四方面，本专利技术还保护含有前文所述的基因组合或前文所述的重组载体的基因工程菌。
14、在具体的实施方案中，所述基因工程菌为分别含有所述嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2以及嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的基因工程菌pichia pastoris x33-egl1、p.pastoris x33-egl2和p.pastoris x33-xyn1。
15、在具体的实施方案中，所述的基因工程菌均采用如下方法构建：所述的含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1、egl2和嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的重组质粒ppiczαa-egl1、ppiczαa-egl2和ppiczαa-xyn1分别通过电转导入宿主菌p.pastoris x33感受态中，接着通过含有25mg·l-1博来霉素的ypd(2％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)葡萄糖，1m山梨醇，ph 6.0)平板进行突变体筛选，30℃培养48h后挑取转化子，经测序验证和预发酵酶活测定无误后获得正确基因工程菌p.pastoris x33-egl1、p.pastoris x33-egl2和p.pastoris x33-xyn1，-80℃甘油保存。
16、所述的嗜酸性内切葡聚糖酶蛋白egl1和egl2以及嗜酸性内切木聚糖酶蛋白xyn1的生产方法如下：
17、1)将基因工程菌p.pastoris x33-egl1、p.pastoris x33-egl2和p.pastorisx33-xyn1分别少量菌体接种到含100mg·l-1博来霉素的bmgy液体培养基中(1％(w/v)酵母粉，2％(w/v)蛋白胨，4×10-5％(w/v)生物素，1.34％(w/v)ynb，1％(v/v)甘油)，黑暗条件下28℃、250rpm摇床培养24h，8000rpm离心5min去上清，收获菌体。
18、2)将各工程菌菌体分别重新转接至含1％甲醇的bmmy液体培养基中(1％(w/v)酵母本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酶组合，其特征在于，所述酶组合由嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2以及嗜酸性内切木聚糖酶XYN1组成；所述嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2如SEQ ID NO.4所示，所述嗜酸性内切木聚糖酶XYN1如SEQ ID NO.6所示。
2.一种与权利要求1所述的酶组合相关的基因组合，其特征在于，所述基因组合包括编码嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1的基因egl1、编码嗜酸性内切葡聚糖酶EGL2的基因egl2以及编码嗜酸性内切木聚糖酶XYN1的基因xyn1组成；所述基因egl1的如核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示；所述基因egl2如核苷酸序列SEQ ID NO.3所示；所述基因xyn1的如核苷酸序列SEQ ID NO.5所示。
3.一种与权利要求2所述的基因组合相关的重组载体组合，其特征在于，所述重组载体组合包括含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1的重组载体、含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2的重组载体以及含有嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的重组载体。
4.根据权利
5.根据权利要求4所述的重组载体组合，其特征在于，重组质粒以pPICZαA表达质粒为出发载体。
6.含有权利要求2所述基因组合或权利要求3所述重组载体的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌分别为Pichiapastoris X33-egl1、Pichia pastoris X33-egl2和Pichia pastoris X33-xyr1。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌Pichia pastorisX33-egl1、Pichia pastoris X33-egl2和Pichia pastoris X33-xyr1构建方法如下：将权利要求5所述的三种重组质粒经PmeI限制性内切酶线性化后分别电转导入表达宿主菌P.pastoris X33，再通过含有25mg·L-1博来霉素的YPD平板筛选，30℃培养48h后，挑取单菌落经测序验证基因序列无误后保存。
9.利用权利要求7或8所述的基因工程菌制备酸性内切葡聚糖酶蛋白EGL1和EGL2以及嗜酸性内切木聚糖酶蛋白XYN1的方法如下：
10.SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示基因编码的嗜酸性内切葡聚糖酶EGL1、EGL2和嗜酸性内切木聚糖酶XYN1三者组合或单独在果汁澄清、动物饲料或生物有机肥木霉孢子生产中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种酶组合，其特征在于，所述酶组合由嗜酸性内切葡聚糖酶egl1、嗜酸性内切葡聚糖酶egl2以及嗜酸性内切木聚糖酶xyn1组成；所述嗜酸性内切葡聚糖酶egl1的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述嗜酸性内切葡聚糖酶egl2如seq id no.4所示，所述嗜酸性内切木聚糖酶xyn1如seq id no.6所示。
2.一种与权利要求1所述的酶组合相关的基因组合，其特征在于，所述基因组合包括编码嗜酸性内切葡聚糖酶egl1的基因egl1、编码嗜酸性内切葡聚糖酶egl2的基因egl2以及编码嗜酸性内切木聚糖酶xyn1的基因xyn1组成；所述基因egl1的如核苷酸序列为seq idno.1所示；所述基因egl2如核苷酸序列seq id no.3所示；所述基因xyn1的如核苷酸序列seq id no.5所示。
3.一种与权利要求2所述的基因组合相关的重组载体组合，其特征在于，所述重组载体组合包括含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl1的重组载体、含有嗜酸性内切葡聚糖酶基因egl2的重组载体以及含有嗜酸性内切木聚糖酶基因xyn1的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体组合，其特征在于，所述重组载体为重组质粒。
5.根据权利要求4所述的重组载体组合，其特征在于，重组质粒以ppiczαa表达质粒为出...
【专利技术属性】
技术研发人员：缪有志，王景梵，谷金，位亚宁，夏燕维，王伟，徐志辉，张瑞福，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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