本发明专利技术公开了一种具有草甘膦耐性的基因及其应用。该基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1、SEQIDNO：3或SEQIDNO：5及其保持抗草甘膦活性的突变基因，以及编码的蛋白质氨基酸序列分别为SEQIDNO：2、SEQIDNO：4或SEQIDNO：6及其在第280到294位的保守区1、第416到433位的保守区2中氨基酸突变，利用该来自于植物的具有草甘膦耐性的基因及其突变制备抗/耐草甘膦植株，可以明显的显示出抗/耐草甘膦效果，这为培育抗/耐草甘膦除草剂作物提供了新的选择，增加抗/耐草甘膦除草剂转基因技术的多样性，从而降低了抗/耐除草剂转基因技术的生态风险。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种具有草甘膦耐性的基因及其应用。该基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1、SEQIDNO：3或SEQIDNO：5及其保持抗草甘膦活性的突变基因，以及编码的蛋白质氨基酸序列分别为SEQIDNO：2、SEQIDNO：4或SEQIDNO：6及其在第280到294位的保守区1、第416到433位的保守区2中氨基酸突变，利用该来自于植物的具有草甘膦耐性的基因及其突变制备抗/耐草甘膦植株，可以明显的显示出抗/耐草甘膦效果，这为培育抗/耐草甘膦除草剂作物提供了新的选择，增加抗/耐草甘膦除草剂转基因技术的多样性，从而降低了抗/耐除草剂转基因技术的生态风险。【专利说明】—种具有草甘膦耐性的基因及其应用
本专利技术属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体地说，本专利技术涉及一种植物源抗/耐草甘膦基因以及该基因编码的蛋白质，并且对其进行人工改造，提供一种人工突变获得高抗草甘膦基因突变体的方法以及基因突变后获得的植物源高抗/耐草甘膦基因。通过遗传转化的方法使该基因在植物中表达而使植物获得对草甘膦的抗性能力，从而可以利用草甘膦于作物田间选择性地防除杂草。本专利技术也可以运用在作物育种、植物细胞培养的筛选。
技术介绍
自从1946年开始使用2，4_D，化学除草剂已走过60多年的历程，为全球粮食生产和农业现代化做出了巨大贡献(Powels and Yu, 2010)。其中草甘膦(N-(膦羧基甲基)甘氨酸)是迄今为止最为重要、应用最为广泛和最优秀的除草剂(Duke and Powles, 2008)。自1974年美国孟山都公司开发草甘膦以来，由于其具有广谱、低毒、安全、无土壤残留的特点，迅速占据了世界除草剂的主导地位。草甘膦毒性作用机理主要是竟争性抑制EPSP合酶即5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)，该酶广泛存在于真菌、细菌、藻类、高等植物体内，但不存在于动物体内。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似物，二者的分子式极为相似，它能与PEP竞争性结合EPSP合酶，形成EPSP合酶.3_磷酸莽草酸(S3P).草甘膦的复合物，阻断EPSP的合成，从而阻断芳香族氨基酸的合成，导致植物死亡。而草甘膦无选择性地杀死作物和杂草，限制了它在农业生产上的使用，同时也给农业生产带来了巨大的损失。自1996开始，抗草甘膦转基因作物(如大豆、玉米、棉花和油菜)研制和商业化，才使得草甘膦被广泛应用于农作物田杂草的防除(Powles，2008)。目前，草甘膦已成为生产量最大的农药品种，占全球农药市场的近20%，年销售超过20亿美元。许多研究者通过多种方法来选育抗草甘膦的作物新品种。目前通过基因工程培育抗`草甘膦植物是最有效的获取抗性作物的手段。基因工程方法多采用细菌来源的抗性EPSP合成酶基因，该基因的产物与草甘膦结合活性下降而不能被其竞争抑制，保证了植物芳香族氨基酸的正常合成。常用的抗性基因来源有鼠沙门氏菌、根癌农杆菌、大肠杆菌、假单胞菌等。许多研究者利用这些抗性基因，采用基因工程的方法获得了表达细菌EPSP合成酶的转基因植物表现对草甘膦的抗性(Sost and Amrherin,1990; Blackburn and Boutin, 2003; Maskellj 1998; Gallo and Irvine, 1996; Zhouet al., 1995; Mannerlof et al., 1997; Penaloza et al., 1995; Zboinska et al.,1992)，其中转基因抗草甘膦大豆已在美国、巴西等国家大面积栽种。但这些来源于细菌的抗性基因作物作为食品或食品原料，其安全性一直是争论的焦点。在植物中也发现了由于EPSP合酶单个氨基酸位点突变造成其对草甘膦具有抗药性。牛筋草(Eleusine indica)对草甘膦的抗性提高了 8?12倍，在于其EPSPS第106位脑氨酸变成了丝氨酸或苏氨酸(Prol06Ser/Thr) (Baerson et al.., 2002; Ng et al.,2003);抗草甘膦的瑞士黑麦草(Lolium rigidum)不同种群的EPSPS的106位脯氨酸有2种不同突变,被苏氨酸或丙氨酸取代(Prol06Thr/Ala) (Wakelin and Preson, 2006; Yuet al., 2007) ;EPSP合酶第182位氨基酸由脯氨酸(P)变成了丝氨酸(S)是多花黑麦草(Lolium multiflorum)种群的草甘膦抗性机制之一(Gonzdilez-Torralva, 2012)。通过这些有效位点的基因突变，降低了 EPSPS对草甘膦的亲和性，从而增强了杂草对草甘膦的抗性。同时，对抗草甘膦杂草EPSPS基因研究证实，杂草对草甘膦的抗药性大多是由氨基酸突变造成的极性变化所致。抗草甘膦牛筋草和瑞士黑麦草EPSPS编码基因106位非极性脯氨酸分别突变为极性丝氨酸和苏氨酸(Baerson, 2002; Wakelin and Preston,2006);抗草甘膦瑞士黑麦草和田旋花EPSPS基因的101位分别由非极性脯氨酸和非极性苯丙氛酸突变为极性丝氛酸(Simarmata and Penner, 2008; Zhang et al., 2011)。氛基酸极性的改变，可能会影响EPSP合酶与草甘膦的亲和性。孟山都公司已经对抗草甘膦牛筋草的EPSPS基因申请了专利保护。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗/耐草甘膦基因和以此为基础的抗/耐草甘膦植物。相对于细菌等来源的抗草甘膦基因，植物来源的进化抗性或天然抗性基因，在培育抗/耐草甘膦除草剂作物后的生态环境和食品安全风险要低于其它生物类别的异源基因，提高民众心理的认可。
技术实现思路
·本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种基于自然界的植物天然耐性为基础，经过前期对大量植物进行的草甘膦耐性筛选得到的新的抗/耐草甘膦基因，并且对其进行改良得到一系列突变基因，利用这些基因可以用来产生转基因抗草甘膦植物，也可作为植物细胞培育中的筛选标记。为了达到上述目的，本专利技术提供了三种具有草甘膦耐性的基因(LS-EPSPS)LsEPSPSU LsEPSPS2 和 LsEPSPS3，核苷酸序列分别为 SEQ ID NO:U SEQ ID NO:3 和 SEQID NO:5。本专利技术还提供了一种抗/耐草甘膦蛋白质多肽，该抗/耐草甘膦蛋白质多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或与上述氨基酸序列相比具有不小84%相同性的氨基酸序列。SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和 SEQ ID NO:6 分别表示为 SEQ ID NO:USEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列。这三种氨基酸序列均包含四个特异性位点，麦冬中为144m, 184i, 232a以及273m，土麦冬和阔叶土麦冬中为146m，186i，234a以及275m，相当于大肠杆菌EPSP合酶氨基酸序列中70、107、153以及192位。氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6表示的蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有草甘膦耐性的基因，该基因的核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1、SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：5。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：强胜，毛婵娟，陈世国，戴伟民，宋小玲，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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