丝/苏氨酸激酶抑制蛋白在治疗化学性肝纤维化药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了丝/苏氨酸激酶抑制蛋白在治疗化学性肝纤维化药物中的应用研究。首次对RKIP在肝纤维化形成过程中的作用机制进行了研究，通过动物实验表明，在肝纤维化形成过程中，RKIP表达水平下降和磷酸化RKIP水平升高与Raf-1/MEK/ERK1,2信号转导途径的激活有关，RKIP和磷酸化RKIP的表达在肝纤维化发生发展中发挥重要作用。RKIP和其上下游生物传导通路可作为药物治疗肝纤维化的重要作用靶标，在制备治疗CCl4诱导的化学性肝纤维化药物中应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及丝/苏氨酸激酶抑制蛋白（Rafkinaseinhibitoryprotein,RKIP）的用途，具体地说是RKIP作为药物作用靶标在制备治疗化学性肝纤维化药物中的应用。
技术介绍
肝纤维化是导致多数慢性性肝脏疾病发生及死亡的主要原因，许多研究证实其尚可逆行，因此阻止或逆转肝纤维化进程成为治疗慢性肝病的重要策略。目前，临床对肝纤维化的治疗仍没有明确的方案和有效治疗药物。近些年来，国内外大量研究表明，干预肝纤维化进程中相关信号通路已成为研究治疗肝纤维化的一个新靶点，是探索治疗肝纤维化的新方法。因此通过干预信号通路的途径，以及将相关的信号通路作为药物干预的靶点，对开发治疗肝纤维化的新药具有重要意义。丝/苏氨酸（Ser/Thr）激酶抑制蛋白(简称：Raf激酶抑制蛋白，英文名：Rafkinaseinhibitoryprotein,RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolaminebindingprotein,PEBP)家族中重要一员。该蛋白是Bernier等首次从牛脑中纯化出一种可以与磷脂酰乙醇胺结合的蛋白，其相对分子质量约为21～23kDa，广泛存在于各种不同的物种中，预示其可能具有重要的生物学功能。RKIP作为信号通路的抑制因子在肝纤维化中的作用仍知之不多。
技术实现思路
本专利技术的目的是研究开发丝/苏氨酸激酶抑制蛋白RKIP作为药物作用靶标在制备治疗CCl4诱导的化学性肝纤维化药物中的应用。本专利技术是基于专利技术人的实验研究而完成的。激酶抑制蛋白在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化发生机制中的调控作用实验将SD雄性大鼠以CCl4诱导形成化学性肝纤维化动物模型，观察研究RKIP、p-RKIP等在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及表达变化，以及Raf-1/MEK/ERK1,2通路的活化情况的作用。结果表明，CCl4油溶液成功复制出大鼠肝纤维化模型，该模型在形成过程中伴随着肝功能标志物的改变，出现肝细胞坏死、变性，肝小叶被破坏，胞浆内出现大量大小不一的脂肪空泡，中央静脉及汇管区周围有大量炎性细胞浸润，同时血清纤维化标志物ALT、AST值明显升高。采用免疫组化检测肝组织RKIP、ERK及其磷酸化蛋白表达，RT-PCR检查RKIP、ERK、Col-I及Col-IIImRNA的表达，Westernblot检测RKIP、ERK等及其磷酸化蛋白的表达，结果表明，在肝纤维化形成过程中，RKIP表达水平下降，同时磷酸化RKIP水平升高。同时磷酸化ERK、Raf-1、MEK-1表达明显增加，表明肝纤维化发生过程中存在Raf-1/MEK/ERK1,2信号转导通路的活化。总之，本专利技术首次对RKIP治疗CCl4诱导的肝损伤、肝纤维化进行了研究，实验表明，在肝纤维化形成过程中，RKIP表达水平下降和磷酸化RKIP水平升高与Raf-1/MEK/ERK1,2信号转导途径的激活有关，RKIP和磷酸化RKIP的表达在肝纤维化发生发展中发挥重要作用，可作为药物治疗肝纤维化的重要作用靶标。在制备治疗CCl4诱导的化学性肝纤维化药物中应用。具体实施方式实验方案：（1）实验动物模型的制备、分组及处理采用四氯化碳（CCl4）制备大鼠肝纤维化模型。SD雄性大鼠，体重200g±20g，SPF级，随机分为4组：Ⅰ组60只、Ⅱ组15只、Ⅲ组15只、Ⅳ组15只。Ⅰ和Ⅲ组大鼠灌胃（i.g.）给予50%CCl4花生油溶液2ml/kg，每周2次，共15w；Ⅱ和Ⅳ组大鼠灌胃同体积的生理盐水。每周称重2次，调整CCl4给予量。其中，第7w-15w，Ⅲ和Ⅳ组大鼠腹腔注射0.5mg/kglocostatin（RKIP的特异性抑制剂），每周2次。在造模6w、10w、13w、15w时，I组分别随机选出部分大鼠，眼球取血，处死，快速分离肝组织，一部分-80℃保存，另一部分用10%福尔马林固定。（2）检测指标①肝组织病理学观察：常规病理检察和电镜观察肝组织超微结构；②血清ALT，AST；③免疫组化检测肝组织RKIP、p-RKIP、ERK、p-ERK的表达；④RT-PCR检测肝组织RKIP、ERK、Col-Ⅰ及Col-ⅢmRNA的表达；⑤Westernblot法检测RKIP、ERK的表达及磷酸化水平；（3）实验结果：①肝组织病理检查情况HE染色及Masson染色病理检查结果显示，正常对照组大鼠肝小叶类圆形，结构完整，肝小叶肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状整齐排列，肝细胞未见变性;中央静脉肝窦也未见充血出血和水肿;汇管区未见纤维组织增生等病理改变。6w、10w、13w、15w阶段的模型对照组均出现正常肝小叶结构被破坏，由圆形或椭圆的假小叶取代，肝细胞可见气球样变及点状坏死，炎细胞浸润。肝小叶内亦有纤维组织增生，随着造模时间延长，胶原沉积在小胆管周围渐多，肝脏广泛纤维结缔组织增生。②血清ALT，AST检测结果显示，模型组大鼠的血清ALT、AST均高于正常组，而模型组间无差异。Locostatin干预后，与正常组比较，NS+locostatin组ALT水平升高（p＜0.05），AST无显著变化；CCl4+locostatin组大鼠的血清ALT、AST均高于正常组大鼠，与15w模型组比较无显著差异。结果见表1。③免疫组化检测大鼠RKIP、p-RKIP、ERK、p-ERK的表达RKIP在正常大鼠肝组织的肝细胞和肝窦周围细胞中均有表达，主要分布在细胞胞浆和胞膜；与正常组比较，随着肝纤维化的发展，模型组大鼠肝脏中RKIP阳性细胞明显减少（p＜0.05或p＜0.01）；p-RKIP在正常组大鼠肝组织的肝细胞和肝窦周围细胞中阳性细胞有少量表达，与正常组比较，模型组大鼠肝脏中p-RKIP表达增强（p＜0.05或p＜0.01）；ERK及p-ERK在正常肝组织中，中央静脉周围、汇管区均有少量表达，模型组大鼠肝组织中可见大量ERK及p-ERK阳性细胞，主要见于汇管区。与正常组比较，随着肝纤维化发展，ERK和p-ERK表达具有递增趋势（p＜0.05或p＜0.01）。Locostatin干预后，与正常组比较，NS+locostatin组和CCl4+locostatin组中大鼠肝组织RKIP表达降低，CCl4+locostatin组中p-RKIP、ERK及p-ERK表达升高；与15w模型组比较，CCl4+locostatin组大鼠肝组织RKIP降低，而p-RKIP、ERK及p-ERK表达升高（p＜0.05或p＜0.01）。④RT-PCR检测大鼠肝组本文档来自技高网...

【技术保护点】
丝/苏氨酸激酶抑制蛋白在制备治疗肝纤维化药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.丝/苏氨酸激酶抑制蛋白在制备治疗肝纤维化药物中的应用。
2.丝/苏氨酸激酶抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：林兴，黄权芳，韦玲，梁春宏，吕淑娟，黄仁彬，张士军，
申请(专利权)人：林兴，
类型：发明
国别省市：广西;45