用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针制造技术

本发明专利技术公开了用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针，其结构如式(I)所示：

Fluorescent probes for the analysis, detection and screening of galactose kinase inhibitors

A fluorescent probe for analyzing, detecting, and screening a galactose kinase inhibitor, whose structure is shown in the formula (I):

【技术实现步骤摘要】
用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针
本专利技术属于生物分析检测领域，特别涉及一种用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针及制备方法及应用。技术背景半乳糖血症是血和尿中半乳糖增多的一种疾病，新生儿或婴幼儿多出现的该疾病是由于半乳糖-l-磷酸尿苷酰转移酶(GALT)遗传性缺失，从而导致半乳糖的第一步代谢产物半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)在患者体内组织和细胞内的大量积蓄而造成的。半乳糖血症的主要症状是营养障碍、白内障、黄疸，腹泻，脓毒症，智力低下和肝脾肿大，新生儿死亡等。半乳糖血症的临床治疗方法主要是静脉葡萄糖补充疗法，新鲜血浆输注，电解质补充以及针对合并败血症患者进行抗生素治疗。半乳糖在分子结构上和糖分类中与葡萄糖是截然不同的单糖。食物中的半乳糖主要来自奶类所含的乳糖。哺乳婴儿所需能量的20％由乳类中的乳糖提供。正常情况下，乳糖进入肠道后即被水解成半乳糖和葡萄糖经肠粘膜吸收。半乳糖被吸收后在细胞内先后经半乳糖激酶(GALK)、半乳糖-l-磷酸尿苷酰转移酶(GALT)和尿苷二磷酸半乳糖表异构酶(GALE)的作用，最终生成l-磷酸葡萄糖进入葡萄糖代谢途径。由于半乳糖的代谢产物半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)在细胞和体内的代谢物积蓄是导致各种脏器官器质性病变的主要原因，因此从根本上预防和治疗半乳糖血症的方法之一是通过有效抑制半乳糖代谢通路中的半乳糖激酶(GALK)避免半乳糖的代谢产物半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)在细胞内的积蓄，从而达到保持患者健康状态的目的(LiuL,TangM,WalshMJ,BrimacombeKR,PraganiR,TanegaC,RohdeJM,BakerHL,FernandezE,BlackmanB1,BougieJM,LeisterWH,AuldDS,ShenM,LaiK,BoxerMB,BioorgMedChemLett.2015Feb1；25(3):721-727)。因此，发现和开发能够有效抑制半乳糖激酶活性的GALK激酶抑制剂，对预防和治疗半乳糖血症非常重要。研究表明，半乳糖激酶(GALK)对半乳糖的代谢过程首先是激酶分子中的天冬氨酸残基对半乳糖结构中的1-位羟基进行去离子化，然后从细胞中的ATP获取一分子磷酸从而完成半乳糖-l-磷酸(Gal-1-P)的生成(参考文献：MegarityCF,HuangM,WarnockC,TimsonDJ.BioorgChem.2011Jun；39(3):120-6.)。上述代谢过程具有很高的特异性，原因是半乳糖激酶不仅特异性地识别半乳糖(而不是其他的单糖。比如葡萄糖，果糖，甘露糖等)，而且半乳糖分子内的1-位羟基的存在对半乳糖成为半乳糖激酶的代谢底物亦非常重要。(见图9)迄今应用于筛选和发现GALK抑制剂的方法，主要是利用半乳糖激酶将半乳糖转化为半乳糖-l-磷酸过程中需要定量消耗ATP的特点，需要利用在实验室制备及纯化后获得的半乳糖激酶蛋白，通过向纯化后的激酶蛋白中加入定量的半乳糖底物和定量的ATP，然后测试由于抑制剂的抑制作用而导致ATP消耗减少最终判断抑制剂的效果和强弱(文献：LiuL,TangM,WalshMJ,BrimacombeKR,PraganiR,TanegaC,RohdeJM,BakerHL,FernandezE,BlackmanB1,BougieJM,LeisterWH,AuldDS,ShenM,LaiK,BoxerMB,BioorgMedChemLett.2015Feb1；25(3):721-727)。这种筛选方法涉及到繁琐的半乳糖激酶的制备与纯化，而且抑制剂本身与ATP的相互作用会对测试结果产生不可避免的干扰。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针。本专利技术的第二个目的是提供一种用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供一种用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂中的用途。本专利技术的技术方案概述如下：一种用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针，其结构如式(I)所示：其中，X为O或NH；R2较好地选自：(A-1)、(A-2)、(A-3)、(A-4)或(A-5)；n＝0‐4。最好是选自：式中，n＝1‐4。R2还可以选自表1列举的具有不同激发波长的荧光团：表1用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：(1)在室温条件下，将式(A-6)或式(A-7)所示的化合物与6-氨基-6-脱氧半乳糖化合物(A-8)进行缩合,得到式(A-9)或式(A-10)所示的半乳糖偶联酰胺产物；其中，X＝O或NH；Y＝Cl或OH；n＝1-4；R3和R4相同或者不同，为羟基保护基；或者R3和R4分别代表邻位羟基的缩醛或缩酮保护基；反应式如下：(2)将步骤(1)获得的(A-9)或(A-10)中的羟基保护基脱保护，或者R3和R4代表的邻位羟基的缩醛或缩酮保护基脱保护，得到式(I)所示用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针，其中，X为O或NH；R2选自(A-4)或(A-5)；n＝1-4。在缩合反应时使用多肽缩合试剂，所述多肽缩合试剂为N，N’-二环己基碳二亚(DCC)，1-羟基苯并三唑(HOBt),六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)或O-苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)。在缩合反应时使用有机碱，所述有机碱为4-二甲氨基吡啶，三乙基胺或二异丙基乙胺。羟基保护基为乙酰基或苄基。邻位羟基的缩醛或缩酮保护基为1,2,3,4-二-氧-异丙叉基。上述用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂中的用途。本专利技术具有以下的有益效果：提供了一种能够直接用在细胞体系中分析、检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针，该探针能够简化以往的半乳糖激酶抑制剂筛选过程，避免使用提纯精制后的半乳糖激酶蛋白，而直接用于任何表达半乳糖激酶的细胞体系中；应用本专利技术的荧光探针能够方便快速地实现分析、测试和筛选半乳糖激酶抑制剂的目的，为发现和开发能够用于预防和治疗半乳糖血症疾病的先导化合物和有效药物提供了有效的手段和有用的工具。附图说明图1为本专利技术荧光探针化合物I-1的激发及发射荧光光谱；图2为本专利技术荧光探针化合物I-3的激发及发射荧光光谱；图3为本专利技术荧光探针化合物I-5的激发及发射荧光光谱；图4为本专利技术荧光探针化合物I-7的激发及发射荧光光谱；图5为本专利技术荧光探针化合物I-1在血红细胞中筛选半乳糖激酶抑制剂的实验结果；图6为本专利技术荧光探针化合物I-3在血红细胞中筛选半乳糖激酶抑制剂的实验结果；图7为本专利技术荧光探针化合物I-5在血红细胞中筛选半乳糖激酶抑制剂的实验结果；图8为本专利技术荧光探针化合物I-7在血红细胞中筛选半乳糖激酶抑制剂的实验结果。图9为半乳糖激酶特异性识别体内半乳糖并对其1-位羟基进行磷酸化代谢的示意图。具体实施方式设计理念是创造一种带有荧光的半乳糖激酶代谢底物(荧光探针)，当荧光探针与细胞内半乳糖激酶的相互作用受到半乳糖激酶抑制剂的影响时产生荧光强度的变化，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针，其结构如式(I)所示：

【技术特征摘要】
1.一种用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针，其结构如式(I)所示：其中，X为O或NH；R2选自(A-1)、(A-2)、(A-3)、(A-4)或(A-5)；n＝0‐4。2.根据权利要求1所述荧光探针，其特征是所述：X为O或NH；R2选自(A-4)或(A-5)；n＝1-4。3.权利要求2的用于分析检测和筛选半乳糖激酶抑制剂的荧光探针的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)在室温条件下，将式(A-6)或式(A-7)所示的化合物与6-氨基-6-脱氧半乳糖化合物(A-8)进行缩合,得到式(A-9)或式(A-10)所示的半乳糖偶联酰胺产物；其中，X＝O或NH；Y＝Cl或OH；n＝1-4；R3和R4相同或者不同，为羟基保护基；或者R3和R4分别代表邻位羟基的缩醛或缩酮保护基；反应式如下：(2)将步骤(1)获得的(A-9)或(A-10)中的羟基保护基脱保护，或者R3和R4代表的邻位羟基的缩醛或...

【专利技术属性】
技术研发人员：高清志，刘胜男，黄振华，
申请(专利权)人：天津澳瑞沃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12