一种测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定蛋白激酶活性的方法，其主要步骤为：选取一组不同浓度的PKA和同一浓度的ATP进行反应，得到一组PKA反应液，再分别将PKA反应液和Na2MoO4溶液滴加干净的金电极表面后烘干，再分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的PKA浓度做标准曲线；最后根据标准曲线计算不同浓度下PKA的活性。本发明专利技术的公开的蛋白激酶抑制剂活性的方法与测定蛋白激酶活性的方法的原理相同。本发明专利技术的方法操作简单、灵敏度高、检测范围宽、且检测用时短，同时可推广到其他磷酸水解酶的活性测定，也为高效、快速、低投入地筛选多种有效的PKA抑制剂提供了新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物传感
，尤其涉及一种利用电化学方法测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的方法。
技术介绍
蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，能够调节细胞内大多数蛋白的功能。蛋白的磷酸化修饰与众多生理过程紧密相关，如信号传导、代谢调控、DNA损伤修复、基因转录和细胞凋亡等。蛋白激酶是一种磷酸转移酶，能够将三磷酸腺苷(ATP)上的γ -磷酸基团转移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)残基上。蛋白激酶是酶家族的重要成员，活性正常的蛋白激酶体系是细胞信号传导运作的核心，但当其活性异常或者过度表达时就会引起某些蛋白磷酸化的异常。人类许多疾病就和蛋白磷酸化异常密切相关，如癌症、糖尿病及老年痴呆等。由于蛋白激酶调控着每个组织、每个器官、甚至每个细胞的生死，从而已成为治疗这些复杂疾病的重要药物靶点。因此，测定蛋白激酶的活性及筛选蛋白激酶抑制剂在生物医学诊断以及酶靶药物开发等领域激起了人们的兴趣。传统测定蛋白激酶的方法一般都是通过蛋白磷酸化的程度，采用放射性同位素标记法、表面等离子共振法、质谱法、荧光法和免疫法等来检测的，这些检测手段和方法在一定程度上促进了对蛋白激酶活性研究，然而各自又具有一定的局限性。放射性元素标记ATP技术，检测方法直接、灵敏度高，但存在放射性污染，不能进行组织标记;免疫法对磷酸化识别抗体的要求较高，专一性不强、费用高。因此，开发一种快速、简便、经济、灵敏度高且无需标记的蛋白激酶活性检测及高通量筛选抑制剂方法是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、灵敏度高、检测范围宽、且检测用时短的利用电化学方法测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的方法。为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为:—种测定蛋白激酶(PKA)活性的方法，包括以下步骤:(I)处理金电极:准备多根金电极并清理干净金电极表面，然后在金电极表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干备用；(2)测定蛋白激酶的活性:选取一组不同浓度的蛋白激酶和同一浓度的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的蛋白激酶反应液和Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶的浓度做标准曲线；(3)根据所述标准曲线计算不同浓度下蛋白激酶的活性。上述的方法，优选的，所述步骤⑵中，ATP浓度为50?500μΜ，ΑΤΡ浓度的选取需进行优化，其优化过程具体为:选取一组不同浓度的ATP分别和同一浓度的蛋白激酶进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的一组蛋白激酶反应液和Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线分别得到峰电流，选取电信号增加最大时对应的ATP浓度即为最优的ATP浓度。更优选的，ΑΤΡ浓度为250μΜ。 上述的方法，优选的，所述步骤⑵中，Na2MoO4溶液的浓度为6?1mM，水浴反应的温度35.5?38.5°C，水浴反应的时间为I?2小时，静置的时间为10?30min。上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，方波伏安曲线测试的条件为:电解液为0.5M的H2SO4，电压为0.1?0.5V，频率为15HZ。上述的方法，优选的，金电极的表面清理过程具体为:将金电极在含Al203的抛光布上进行抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗，用氮气吹干。本专利技术还提供一种测定蛋白激酶抑制剂活性的方法，包括以下步骤:(I)处理金电极:准备多根金电极并清理干净金电极表面，然后在金电极表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干备用；(2)测定蛋白激酶抑制剂的活性:选用一组不同浓度的蛋白激酶抑制剂分别和同一浓度的蛋白激酶、同一浓度的ATP进行水浴反应，再分别将得到的反应液与Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行扫方波伏安曲线测试，根据伏安曲线分别得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶抑制剂的浓度做拟合曲线；(3)根据所述拟合曲线计算不同浓度下蛋白激酶抑制剂对蛋白激酶活性的抑制程度。上述的方法，优选的，所述步骤⑵中，ATP浓度为50?500μΜ，ΑΤΡ浓度的选取需进行优化，其优化过程具体为:选取一组不同浓度的ATP分别和同一浓度的蛋白激酶进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的一组蛋白激酶反应液和Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线分别得到峰电流，选取电信号增加最大时对应的ATP浓度即为最优的ATP浓度。更优选的，ΑΤΡ浓度为250μΜ。上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，Na2MoO4的浓度为Na2MoO4的浓度为6?1mM;水浴反应的温度35.5?38.5°C，水浴反应的时间为I?2小时，静置的时间为10?30min。上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，方波伏安曲线测试的条件为:电解液为0.5M的H2SO4，电压为0.1?0.5V，频率为15HZ。上述的方法，优选的，所述步骤(I)中，金电极的表面清理过程具体为:将金电极在含Al 203的抛光布上进行抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗，用氮气吹干。本专利技术的原理如图1所示，是基于蛋白激酶PKA可以催化水解三磷酸腺苷ATP生成二磷酸腺苷(ADP)和游离的磷酸根，且磷酸根在酸性条件下与钼酸钠反应生成能产生电信号的磷钼酸钠沉淀，电信号的大小与蛋白激酶活性成正相关，从而可以通过电化学法测定蛋白激酶PKA的活性及抑制性。与现有技术相比，本专利技术的优点在于:(I)本专利技术的方法避开了现有技术中繁琐的蛋白磷酸化的步骤，直接通过电化学信号大小来测定PKA水解ATP产生的游离磷酸根的量，从而反映出蛋白激酶PKA的活性。该方法操作简单、灵敏度高、检测范围宽、且检测用时短，具体的表现为本专利技术可以在0.0005?500U/mL范围内测定蛋白激酶PKA的活性，跨越5个数量级，检测范围宽。本专利技术的灵敏度高，本专利技术的检测线可以达到2U/L(以信噪比为3的方法)，远远低于之前文献报道的基于半合成荧光法测定PKA活性(500U/L)、石墨烯量子点测定PKA活性(30U/L)和银纳米簇测定PKA活性(500U/L)等。本专利技术省去了常规繁琐的蛋白磷酸化过程，只是通过“混合-检测”就可以在I.5个小时完成整个步骤，用时短，操作方便;同时可推广到其他磷酸水解酶的活性测定。(2)本发的方法操作简单、灵敏度高，这为高效、快速、低投入地筛选多种有效的PKA抑制剂提供了新的思路。【附图说明】图1为本专利技术的原理不意图。图2为本专利技术的实施例1中不同浓度的PKA电化学响应信号图。图3为本专利技术的实施例1中浓度范围为5U/L?500U/mLPKA活性对应的标准曲线图。图4为本专利技术实施例2中不同浓度的PKA抑制剂H_89的电化学响应信号图。图5为本专利技术实施例2中不同浓度的PKA抑制剂对PKA活性抑制得曲线拟合图。【具体实施方式】为了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定蛋白激酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)处理金电极：准备多根金电极并清理干净金电极表面，然后在金电极表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干备用；(2)测定蛋白激酶的活性：选取一组不同浓度的蛋白激酶和同一浓度的ATP进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的蛋白激酶反应液和Na2MoO4溶液滴加在步骤(1)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶的浓度做标准曲线；(3)根据所述标准曲线计算不同浓度下蛋白激酶的活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：阳明辉，申聪聪，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43