一种羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重组酶的制备制造技术

本发明专利技术提供了一种新型羧肽酶及其基因序列，新型羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达和纯化方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白水解酶S1家族，特命名为Aus?CpA，相应的基因序列命名为Aus?cpA。Aus?CpA具有较好的活性和稳定性，有较大工业化生产的潜力和经济价值，也为其他羧肽酶的研究奠定了理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种羧肽酶(Aus CpA)基因的克隆及重组酶的制备
本专利技术涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶基因工程菌的构建，以其重组羧肽酶的表达及酶活测定方法，属于生物工程

技术介绍
羧肽酶(Carboxyp印tidase)是一类肽链端水解酶，作用于肽链的游离羧基末端释放单个氨基酸，其在医药和食品工业领域有着广泛的应用。在医药领域，可用于重组人胰岛素的生产，肿瘤抗体导向酶的前药治疗，以及作为诊断急性胰腺炎轻重程度的血清标记等；在食品工业上，羧肽酶可作用于苦味肽，水解肽链羧基端的疏水性氨基酸，达到脱苦的目的。另外，羧肽酶还可用于多肽的氨基酸测序。羧肽酶有小麦羧肽酶、动物羧肽酶和微生物羧肽酶，其中，动物来源的羧肽酶主要存在于猪和牛等的胰脏中，数量非常有限，价格昂贵，其应用因此而受到限制。而微生物来源的羧肽酶来源广泛，目前已在酵母和霉菌中检测到羧肽酶的存在。因此，利用微生物发酵生产羧肽酶具有广阔的应用前景。曲霉(Aspergillus)中存在的羧肽酶主要为丝氨酸羧肽酶，主要存在液泡中，在酸性环境下，它们同时具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解等多个重要环节。亚夫尔在其专利技术专利(公开号CN95191058.2)中报道了编码黑曲霉羧肽酶的基因，其产生的羧肽酶存在于液泡中，可降解异源蛋白。Ichishima 等人分离得到的一株黑曲霉液体发酵生产羧肽酶，酶活为360mU/mL滤液。Krishnan等人用清酒曲培养基固体发酵培养黑曲霉产羧肽酶酶活为60. 5U/mg。Morita等人用土豆葡萄糖琼脂培养基固体发酵生产羧肽酶0，酶活为463. 0mkat/kg(27. 780U/mg)。综上所述，羧肽酶广泛存在于曲霉中，但目前无论是液态发酵或固态发酵，微生物产羧肽酶活力均较低，导致了羧肽酶的生产和应用成本高，从而限制了该酶的广泛应用。基因工程羧肽酶纯度高、不含其他蛋白酶，不含动物源性的任何物质，终产物不需进行病毒等的检疫等，不含胰蛋白酶抑制剂-PMSF，同时，利用基因工程菌生产羧肽酶不受动、植物原料来源的限制、不表达需要大面积的占地种植，也不受季节气候的影响，不破坏资源，不污染环境，是一种安全、高效、高产、高质的高新技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种羧肽酶及其基因序列，羧肽酶工程菌的构建，以其重组羧肽酶的高效表达方法，经生物信息学分析确定该酶属于蛋白酶Sl家族，命名为Aus CpA, 相应的基因序列命名为Aus cpA0 Aus CpA具有较好的活性和稳定性，有较大的工业化生产的潜力和经济价值。本专利技术的技术方案一种来源于A.USamii EOOl的羧肽酶，其全基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :1，全基因获取的过程如图1所示。A.usamii EOOl已在文献宇佐美曲霉木聚糖酶基因xyn II在不同毕赤酵母中的分泌表达，生物加工过程，第6卷第2期，2008年3月中公开，本专利技术人承诺该微生物在20 年内向公众发放。所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :2。所述的羧肽酶基因的克隆及表达方法(I)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成首先对Aspergillus terreus>Aspergi 1 Ius clavatus禾口 AspergiIlus niger 的羧肽酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA 进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘AucpA-3F2 5‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘提取A. usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa 生产的 RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0 中的说明书进行RT-PCR，经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因3'端cDNA序列。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列。(2)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；AucpA-5Rl 5‘ -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘AucpA-5R2 5‘ -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘按照TaKafei生产的5' -Full RACE Kit中的说明书进行5‘ -RACE，最后经过两轮PCR可以得到羧肽酶基因5'端cDNA序列，将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA5'，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列。(3)A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA_5Rl为引物进行第一轮PCR，T-PrimerF和AucpA_R2为引物第二轮PCR，经过两轮PCR得到羧肽酶基因 5'端调控序列，将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpAP，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列。(4)A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列的合成以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增3‘端调控序列的正向弓丨物 AucpA-F 1 禾口 AucpA-F2 ；AucpA-Fl 5' -GGGAATACTATCTACTATGGG-3‘AucpA-F2 5' -GTGATTATCAGTGCCTGGTG-3‘利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerR和AucpA-Fl为引物进行第一轮PCR ；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerR和AucpA-F2为引物进行第二轮 PCR;将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与PUCm-T连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3T，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端调控序列。(5)A. usamii EOOl羧肽酶基因的生物信息学分析将Aus cpA的5'端cDNA与3'端cDNA进行序列拼接，得到转录起始位点至PolyA 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的羧肽酶，其完整的基因序列为 SEQ ID NO :1ο2.如权利要求1所述的羧肽酶，其氨基酸序列为SEQID NO :2。3.A. usamii EOOl羧肽酶基因全基因序列获得的方法(1)A.usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列的合成首先对 Aspergillus terreus、Aspergillus clavatus 禾口 Aspergillus niger 的羧妝酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列。然后对它们的mRNA 进行同源比对，寻找出对应的核苷酸序列后设计两条简并引物AucpA-3Fl和AucpA-3F2 ；AucpA-3Fl 5' -TTGAGAAYCCDTACTCGT-3‘AucpA-3F2 5 ‘ -ACTGGAGARAGTTAYGCG-3‘按照TaKaRa生产的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O中的说明书进行RT-PCR 以Oligo dT-AdaptorPrimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13PrimerM4和AucpA_3Fl 为引物进行第一轮 PCR(94°C，2min ；94 °C, 30s, 48 C, 30s, 72 °C，90s，30 个循环；72 C, IOmin)；以第一轮的PCR产物为模板、M13Primer M4和AucpA_F2为引物进行第二轮 PCR(940C，2min ；94°C，30s, 48°C，30s, 72°C，90s, 30 个循环；72°C，IOmin)；将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与 pUCm-Τ连接，转化JM109获重组质粒pUCm-T-AucpA3 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列；(2)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列的合成以A. usamii EOOl羧肽酶基因3'端cDNA序列设计两条扩增5‘端cDNA序列的反向引物 AucpA-5Rl 和 AucpA-5R2 ；AucpA-5Rl 5' -ACTGACCAATACAGGGAT-3‘AucpA-5R2 5' -AGCAGCGGATATGTAAGGA-3‘按照 TaKaRa 生产的 5‘ -Full RACE Kit 中的说明书进行5' -RACE:以5' RACE Outer Primer和AucpA-5Rl为引物进行第一轮 PCR(94°C，3min ；94°C，30s，47°C，30s，72°C，lmin，30 个循环；72°C, IOmin)；以第一轮的 PCR 产物为模板、5' RACE Inner Primer 和 AucpA5_R2 为引物进行第二轮 PCR(94 °C，3min ； 94°C，30s，51°C，30s, 72°C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；将两轮 PCR 产物用 1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marker做对照，将目的条带割胶回收并与pUCm-T连接， 转化JM109获重组质粒pUCm-T-AuCpA5 ‘，经酶切鉴定后送上海生工进行序列测定，得出 A. usamii EOOl羧肽酶基因5'端cDNA序列；(3)A.usamii EOOl羧肽酶基因5'端调控序列的合成利用我们前期报道的T载体介导-PCR方法，以T-PrimerF和AucpA-5Rl为引物进行第一轮 PCR(94C，4min ；94°C，30s, 47C，30s, 72C，lmin, 30 个循环；72°C，IOmin)；然后以第一轮PCR产物为模板、T-PrimerF和AucpA_R2为引物进行第二轮PCR(94°C，^iin -MV, 30s, 51 °C, 30s, 72°C，lmin, 30个循环；72°C，IOmin)；将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，250bp DNA Ladder Marke...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，闵柔，邬敏辰，黄芳，曾研，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：