α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株制造技术

本发明专利技术涉及一种α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株，所述的α淀粉酶的氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ?ID?NO:1。用于表达α淀粉酶的黑曲霉P11，其保藏编号为CGMCC?No.6513。本发明专利技术所得到的重组菌种能够表达棒曲霉α淀粉酶AclaP11，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的淀粉酶的酶活力。同时，所得重组α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了AclaP11的应用领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于淀粉酶的分离表达
，具体涉及一种来源于棒曲霉(Aspergillus clavatus)的α淀·粉酶，以及该α淀粉酶在丝状真菌宿主细胞(诸如黑曲霉(Aspergillus niger)中的异源表达。
技术介绍
α淀粉酶(E. C. 3. 2.1.1)能够催化寡糖和多糖中的1，4_ α -糖苷键的内水解，其以随机的方式作用于淀粉、糖原以及相关多糖和寡糖，释放出α构型的还原基团。目前α淀粉酶广泛的用于多种工业用途，例如烘焙糕点、酿酒、玉米浆和乙醇生产以及醋发酵等领域。α淀粉酶的来源非常广泛，可以从动物、植物和微生物中分离出来。其中微生物来源的淀粉酶具有来源丰富、性能多样和易于工业化生产的特点，可满足多种工业应用需求，在工业上的应用也最为广泛。在现代工业的淀粉质处理过程中，微生物淀粉酶的水解方法已经彻底取代传统的化学水解方法。虽然有多种微生物可以产生α淀粉酶，包括丝状真菌、酵母、细菌和放线菌等。但是，目前能够满足工业应用需求的α淀粉酶主要来源于细菌和丝状真菌，细菌α淀粉酶通常来源于芽孢杆菌属(Bacillus)，真菌α淀粉酶通常来源于曲霉菌属(Aspergillus)。其中由真菌产生的α淀粉酶即称为真菌α淀粉酶。在目前已报道的文献中，可以粗略的按酶学性质或作用条件将真菌α淀粉酶分为3种类型(I)中性真菌α淀粉酶与细菌α淀粉酶不同，真菌α淀粉酶的来源相对较少，大多数真菌α淀粉酶的作用温度和PH都比较温和，如最适作用pH在5. O 5. 5之间，最适作用温度为50 55°C左右，当温度超过60°C酶开始失活。目前商品化生产最多、应用也最为广泛的来源于米曲霉(变种)的α淀粉酶即属于这一酶种。(2)耐热或耐酸性真菌α淀粉酶此类酶在pH 2. 5 4. 5之间，作用温度在超过60°C时仍具有良好的热稳定性。与中性真菌α淀粉酶相比，耐热或耐酸性真菌α淀粉酶可以简化液化、糖化过程，减少制糖等淀粉深加工过程中染菌几率并降低相应生产成本。这部分酶种目前工业上已经开始生产使用，且具有很大的开发利用潜力。(3)具有生淀粉酶活力的真菌α淀粉酶该酶种除具有水解可溶性淀粉或其他糊化淀粉能力外，还具有生淀粉水解能力，在生料酒精行业的同步糖化发酵(SSF)中，与糖化酶配合使用，可以大幅度提高淀粉的利用速率和效率，并有效提闻酒精广率。已报道有多种α淀粉酶基因在不同宿主中得到表达，其中真菌α淀粉酶基因的异源表达主要集中在真核表达系统。与原核表达系统(如大肠杆菌表达系统或芽孢杆菌表达系统等)相比，真核表达系统在表达真核来源的异源蛋白时具有很大的优势，如翻译后加工修饰(如糖基化、二硫键的形成)、内含子的识别、信号肽的剪除和肽链的正确折叠与分泌等。此外，有多种真菌表达系统被美国FDA列为GRAS (generally recognized as safe)菌株，使得对一些食品或医药用异源蛋白的生产和应用更易获得相关机构的认可和批准。目前，有大量来自曲霉属(Aspergillus)的α淀粉酶已经被报道并用于工业生产，但是仅有极少数文献报道来源于棒曲霉(A. clavatus) α淀粉酶。本专利技术从棒曲霉中克隆得到了一种α淀粉酶，并在黑曲霉中克隆表达，且酶活力大大高于其在野生型中的酶活。另外，由于棒曲霉被认为是有毒菌株，而黑曲霉则被认为是安全菌(GRAS)，因此本专利技术扩大棒曲霉的应用范围(如食品领域)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种α淀粉酶及表达α淀粉酶的菌株，以弥补现有技术的不足。本专利技术筛选出的α淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，其一种编码mRNA序列为 SEQ ID NO:2。在第二个方面，本专利技术涉及酶组合物，其包含上述的α淀粉酶。本专利技术另一个方面涉及用于表达上述α淀粉酶的曲霉菌株；一种表达α淀粉酶的黑曲霉(Aspergillus niger)Pll菌株，已于2012年9月4日保存在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No. 6513。本专利技术所得到的重组菌种能够表达棒曲霉α淀粉酶AclaPll，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活(AclaPll在野生菌种无可检测到的酶活)，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的淀粉酶的酶活力。同时，所得重组α淀粉酶是由食品安全菌(GRAS)黑曲霉分泌所得，扩大了 AclaPll的应用领域。附图说明图1 :本专利技术使用的pGm质粒图谱；图2 :蛋白SDS-PAGE凝胶图，显示了黑曲霉转化子的AclaPlI的表达情况，以及野生菌和宿主菌黑曲霉Gl的蛋白表达情况，其中泳道I所示为蛋白标准分子量标记，由左至右为116. OkD, 66. 2kD，45kD和35kD ;泳道2所示为黑曲霉宿主Gl在发酵5d后的蛋白表达情况；泳道3所示为野生菌的蛋白表达情况，其无可检测到的蛋白表达。所示为泳道4AclaPll淀粉酶表达情况,在55kDa处可以看到清晰蛋白条带。图3 :黑曲霉转化子表达的AclaPll的pH稳定性；图4 :黑曲霉转化子表达的AclaPll的温度稳定性。具体实施例方式本专利技术用到了在遗传工程和分子生物学领域中常用的常规技术和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)等参考书中所记载的技术。但是，这并不意味着将本专利技术限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，本领域的普通技术人员可以选用已公开的技术来实施本专利技术实施例中记载的方案。除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本专利技术所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY,3nd Ed. (Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)为技术人员提供了本专利技术中所使用的许多术语的一般性解释，具体如下如本文所用，术语“淀粉”指植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何物质，包括具有(C6HltlO5)x的直链淀粉和支链淀粉，其中X可以是任何数字。具体而言，该术语指任何基于植物的物质，包括但不限于谷物、草、块茎和根，更具体而言，小麦、燕麦、玉米、黑麦、稻、高粱、糠、木薯、粟、马铃薯和甘薯。如本文所用，术语“ α淀粉酶”指催化1，4- α -糖苷键水解的酶。这些酶也被描述为在含有1，4-α -连接的D-葡萄糖单位的多糖中完成1，4- a -D-糖苷键的外切或内切水解的酶。另一个用于描述这些酶的术语是“糖原酶(glycogenase) ”。如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体是，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰，或者所述细胞来自于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然 (非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因，但这些基因异常表达、表达不足或者完全不表达。如本文所用，术语“蛋白质”和“多本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α淀粉酶，其特征在于所述的α淀粉酶氨基酸序列为SEQ?ID?NO:1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王华明，闫真，
申请(专利权)人：天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：