一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆、表达及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆、表达及应用。通过提取该金属硫蛋白基因，设计引物TAC‑F7、TAC‑R5，经PCR扩增后与表达载体进行连接，构建重组质粒；将重组质粒转化入表达菌株，构建重组基因工程菌；建立了该重组蛋白的表达与纯化方法。该低温嗜盐α‑淀粉酶核苷酸序列及编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，其信号肽的基因和氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。该淀粉酶具有如下性质：最适温度20℃，最适pH 8.0，最适盐浓度为1M NaCl；作为一种新型的低温嗜盐酶制剂，可有效的用于食品、发酵、医药、皮革、酿造、饲料、纺织和洗涤剂等工业中。

And the application of a low-temperature halophilic alpha amylase gene cloning and expression of

The invention provides a low temperature alpha amylase halophilic gene cloning, expression and application. By extracting the metallothionein gene, TAC F7, TAC primers were designed R5 connected by PCR amplification and expression vector to construct recombinant plasmid; recombinant plasmid transformed into E.Coli strain, the recombinant gene engineering bacteria; established the recombinant protein expression and purification method. The low temperature alpha amylase halophilic nucleotide sequence and amino acid sequence encoding sequences such as SEQ NO:1 and ID list SEQ ID in NO:2 gene and amino acid sequence of the signal peptide is shown in the sequence list of SEQ ID and SEQ NO:3 ID NO:4. The amylase has the following properties: the optimum temperature is 20 degrees centigrade, the optimum pH 8, the optimum salt concentration of 1M NaCl; as a new type of low temperature halophilic enzymes, can be effectively used in food, fermentation, pharmaceutical, brewing, leather, textile, detergent and feed industry.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种低温嗜盐α-淀粉酶的基因克隆、表达及应用。
技术介绍
α-淀粉酶是一种重要的酶制剂，广泛分布于动物、植物和微生物中，在食品、发酵、医药、皮革、酿造等行业均有应用。但目前工业上应用较多的淀粉酶为中高温的α-淀粉酶，它们在0℃-20℃范围内活力很低，不适宜用于要求低温处理的食品、饲料、纺织和洗涤剂等工业中。而低温α-淀粉酶能克服中高温淀粉酶在这方面的缺陷，在30℃以下表现出良好的催化活性，且在0℃保持酶活性。它能更好的提高生产效率和产品质量，可以降解有机污染物、生产洗涤剂添加剂、生产精细化学药品以及用去除土壤和水作用域中的污染物和有毒物质等，具有很高的工业应用价值。然而，目前对低温α-淀粉酶的研究还比较少，商业化的低温α-淀粉酶就更少，因此要满足工业需求，新型低温淀粉酶的不断发现研究和规模化生产就显得尤为重要了。随着全球范围内节能环保的日益重视，低温α-淀粉酶在工业中的应用就显得愈发重要，因此，开展新型低温α-淀粉酶及其环境适应性的研究，具有较好的理论价值与市场开发前景，其应用的社会意义和生态效应重大。此外，国内外筛选出多种新的淀粉酶菌株，但普遍因为活性差或者稳定性不高、或者逆境适应能力不强等原因，限制了在工业上的应用。因此，如何得到性质优良，表达活力高的菌株成为研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于极地适冷细菌Pseudoalteromonassp.AN175的低温嗜盐α-淀粉酶基因克隆、表达及应用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：本专利技术提供一种低温嗜盐α-淀粉酶的基因克隆与表达方法，具体包括如下步骤：(1)引物的设计与合成：根据测序所得的低温α-淀粉酶基因序列，设计的引物为：上游TAC-F7：5’CGCGGATCCAAAACCTTTACTTTGAGTGC3’下游TAC-R5：5’CCGCTCGAGCAGTGTGTTATTTAGCAAC3’；引物分别带有BamHI和XhoI两种酶的酶切位点和三个保护碱基，上游TAC-F7的酶切位点为“GGATCC”，下游TAC-R5的酶切位点为“CTCGAG”；(2)目的基因的扩增：提取Pseudoalteromonassp.AN175细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，利用引物TAC-F7、TAC-R5来扩增目的基因；(3)重组质粒的构建：利用BamHI与XhoI两种限制性内切酶对PCR回收产物以及表达载体进行双酶切，并对酶切产物进行纯化回收；将酶切后的目的基因及表达载体的纯化产物进行连接。(4)重组基因工程菌的构建：将重组质粒转化表达菌株的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行菌落PCR和测序鉴定；(5)低温淀粉酶基因的诱导表达：①将含重组质粒的单菌落接种于50mLLB液体培养基(含Kana)的250mL锥形瓶中，37℃过夜培养；②取5mL过夜的菌液于装有250mLLB液体培养基(含Kana)的500mL锥形瓶中，200r/min振荡培养至OD600值约为0.6时，在诱导瓶中加入100mMIPTG至终浓度0.7mM，37℃摇床培养诱导表达；④将生长良好的含有淀粉酶基因的发酵细菌的全部菌液进行离心处理，将离心的菌体加入二氧化硅和6mL预冷的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，置于冰水中进行超声破碎；收集上清液和沉淀并用8M尿素溶解沉淀；(6)目的蛋白的纯化：采用凝胶层析及镍柱亲和层析两步法进行目的蛋白纯化，200mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白，通过SDS-PAGE电泳检测，获得纯化的低温嗜盐α-淀粉酶。根据上述基因克隆与表达方法，得到一种低温嗜盐α-淀粉酶基因的核苷酸序列为：SEQIDNO：1；该基因编码的低温嗜盐α-淀粉酶，其氨基酸序列为：SEQIDNO：2；其信号肽的基因序列为：SEQIDNO：3，氨基酸序列为：SEQIDNO：4。本专利技术低温嗜盐α-淀粉酶基因也可以是编码由序列表中SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他任何核苷酸序列。本专利技术低温嗜盐α-淀粉酶不仅限于SEQIDNO：2序列表中所示的氨基酸序列，还可以是SEQIDNO：2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有相同的蛋白活性的由SEQIDNO：2所示序列衍生的蛋白质的氨基酸序列。本专利技术提供一种低温嗜盐α-淀粉酶的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取酵母浸粉5.0g，四水磷酸铁0.1g，氯化钙5.0g，可溶性淀粉10g，氯化钠50g，用过滤陈海水定容至1000ml，pH6.0，121℃湿热灭菌20min，制备发酵培养基，将活化的Pseudoalteromonassp.AN175菌种接种至发酵培养基中进行菌种培养；(2)取培养9天后的粗酶液进行硫酸铵沉淀纯化，将所得的酶液装入透析袋透，PEG-20000浓缩至10ml；(3)将上述酶液上DEAE-52离子交换柱，用50mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)进行平衡，用含0.3MNaCl的50mMTris-HCl缓冲液进行洗脱；(4)将DEAE-52离子交换层析所得酶活高的峰值对应收集管酶液合并，用于SephadexG-75凝胶层析上样；50mMTris-HCl(pH8.5)缓冲液洗脱；用浓度为5％的浓缩胶、浓度为12％的分离胶电泳；考马斯亮蓝染色、脱色；(5)分离纯化结果测定：采用DNS法测定淀粉酶活力，采用Brandford法测定蛋白质的含量。本专利技术的有益效果为：1.本专利技术对来源于极地适冷细菌Pseudoalteromonassp.AN175的低温嗜盐α-淀粉酶基因进行了成功克隆和测序。建立该基因的克隆与表达方法，首次确定其全部基因序列，并在Genbank登记，登记号为KC306394.2。该基因全长1722bp，编码573个氨基酸，分子量10.3kDa，等电点4.9。2.本专利技术所提供的低温嗜盐α-淀粉酶的分离纯化方法，并确定该酶具有如下性质：最适温度20℃，最适pH8.0，0℃时仍有51.5％的活性，最适盐浓度为1MNaCl，5MNaCl时仍保持87.7％的活性。与其他酶类相比，该酶为一种具有适冷性和耐盐性的新型低温α-淀粉酶，可以在常温和高盐环境下保持高活性。3.低温酶酶活及催化效率高，大大缩短反应时间并省去昂贵的加热系统，过程易于控制，节能环保。4.温和的热处理即可使低温酶活力丧失，有助于提高产品质量。5.作为一种新型的低温嗜盐酶制剂，通过对该酶进行基因克隆、表达、性质分析和功能研究，可将其用于食品、发酵、医药、皮革、酿造、饲料、纺织和洗涤剂等工业中。附图说明图1为PCR扩增目的基因结果；图2为转化大肠杆菌BL21的菌落PCR验证结果；图3为淀粉酶的纯化结果；图4为不同时间点的小量表达诱导结果；图5为不同浓度IPTG的诱导结果；图6为低温淀粉酶大量表达的结果；图7为不同温度下的大量诱导；图8为DEAE-52离子交换层析的结果；图9为SephadexG-75凝胶过滤层析的结果；图10为不同温度对淀粉酶活性影响的测量；图11为不同PH值对淀粉酶活性影响的测量；图12为不同盐浓度对淀粉酶活性影响的测量。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术的具体实施方式作进一步详细的说明。实施例1：淀粉酶基因的克隆与表达(1)LB培养基的制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低温嗜盐α‑淀粉酶的基因克隆与表达方法，其特征为，包含如下步骤：(1)引物的设计与合成：根据测序所得的低温α‑淀粉酶基因序列，设计的引物为：上游TAC‑F7：5’CGCGGATCCAAAACCTTTACTTTGAGTGC 3’下游TAC‑R5：5’CCGCTCGAGCAGTGTGTTATTTAGCAAC 3’；引物分别带有BamH I和Xho I两种酶的酶切位点和三个保护碱基，上游TAC‑F7的酶切位点为“GGATCC”，下游TAC‑R5的酶切位点为“CTCGAG”；(2)目的基因的扩增：提取Pseudoalteromonas sp.AN175细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，利用引物TAC‑F7、TAC‑R5来扩增目的基因；(3)重组质粒的构建：利用BamH I与Xho I两种限制性内切酶对PCR回收产物以及表达载体进行双酶切，并对酶切产物进行纯化回收；将酶切后的目的基因及表达载体的纯化产物进行连接；(4)重组基因工程菌的构建：将重组质粒转化表达菌株的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行菌落PCR和测序鉴定；(5)低温淀粉酶基因的诱导表达：①将含重组质粒的单菌落接种于含卡那霉素的50mL LB液体培养基的250mL钳形瓶中，37℃过夜培养；②取5mL过夜的菌液于装有含卡那霉素的250mL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，200r/min振荡培养至OD600值约为0.6时，在诱导瓶中加入100mM IPTG至终浓度0.7mM，37℃摇床培养诱导表达；④将生长良好的含有淀粉酶基因的发酵细菌的全部菌液进行离心处理，将离心的菌体加入适量二氧化硅和6mL预冷的50mM pH 7.0磷酸缓冲液，置于冰水中进行超声破碎；收集上清液和沉淀并用8M尿素溶解沉淀；(6)目的蛋白的纯化：采用凝胶层析及镍柱亲和层析两步法进行目的蛋白纯化，200mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白，通过SDS‑PAGE电泳检测，获得纯化的低温嗜盐α‑淀粉酶。...

【技术特征摘要】
1.一种低温嗜盐α-淀粉酶的基因克隆与表达方法，其特征为，包含如下步骤：(1)引物的设计与合成：根据测序所得的低温α-淀粉酶基因序列，设计的引物为：上游TAC-F7：5’CGCGGATCCAAAACCTTTACTTTGAGTGC3’下游TAC-R5：5’CCGCTCGAGCAGTGTGTTATTTAGCAAC3’；引物分别带有BamHI和XhoI两种酶的酶切位点和三个保护碱基，上游TAC-F7的酶切位点为“GGATCC”，下游TAC-R5的酶切位点为“CTCGAG”；(2)目的基因的扩增：提取Pseudoalteromonassp.AN175细菌基因组DNA；以细菌基因组DNA为模板，利用引物TAC-F7、TAC-R5来扩增目的基因；(3)重组质粒的构建：利用BamHI与XhoI两种限制性内切酶对PCR回收产物以及表达载体进行双酶切，并对酶切产物进行纯化回收；将酶切后的目的基因及表达载体的纯化产物进行连接；(4)重组基因工程菌的构建：将重组质粒转化表达菌株的感受态细胞，并筛选阳性克隆，进行菌落PCR和测序鉴定；(5)低温淀粉酶基因的诱导表达：①将含重组质粒的单菌落接种于含卡那霉素的50mLLB液体培养基的250mL钳形瓶中，37℃过夜培养；②取5mL过夜的菌液于装有含卡那霉素的250mLLB液体培养基的500mL锥形瓶中，200r/min振荡培养至OD600值约为0.6时，在诱导瓶中加入100mMIPTG至终浓度0.7mM，37℃摇床培养诱导表达；④将生长良好的含有淀粉酶基因的发酵细菌的全部菌液进行离心处理，将离心的菌体加入适量二氧化硅和6mL预冷的50mMpH7.0磷酸缓冲液，置于冰水中进行超声破碎；收集上清液和沉淀并用8M尿素溶解沉淀；(6)目的蛋白的纯化：采用凝胶层析及镍柱亲和层析两步法进行目的蛋白纯化，200mM咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白，通过SDS-PAGE电泳检测，获得纯化的低温嗜盐α-淀粉酶。2.根据权利要求1所述的一种低温嗜盐α-淀粉酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：阚光锋，王晓飞，史翠娟，解秋菊，文华，邬志惠，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学威海，
类型：发明
国别省市：山东;37