本发明专利技术公布了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术以嗜碱芽孢杆菌（Bacillus?alcalophilus）JN21(CCTCC?NO:M?2011231)淀粉酶为母本，采用分子生物学技术对嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列进行定点突变。在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶在50°C的半衰期由对照（突变前）例的15.3min提高到43.8min。利用此策略可以显著提高淀粉酶的热稳定性，为其工业化生产提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其方法，具体涉及一种热稳定性提高的碱性淀粉酶突变体及其制备方法。
技术介绍
淀粉酶是最早用于工业生产的酶制剂，是迄今用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。碱性淀粉酶在高PH环境下具有稳定性和活性，因而在工业生产中有较高的应用价值，现已用于纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品等行业。但来源于野生菌株未经改造的碱性淀粉酶在热稳定性等方面存在一定局限性，限制了其应用范围。因此基于已得到的碱性淀粉酶在大肠中的表达平台，利用定点突变，对碱性淀粉酶进行分子改造，以期得到酶学性质更适合工业应用的碱性淀粉酶。·
技术实现思路
本专利技术提供了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体，其特征在于，对淀粉酶结构域A、B、C内的一个或多个氨基酸进行替换，提高了淀粉酶的热稳定性。所述淀粉酶突变体是以SEQ ID NO.1为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合得到的突变体。能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的载体也属于本专利要求保护的范围。能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也属于本专利要求保护的范围。本专利技术还提供一种制备所述淀粉酶突变体的方法，是将淀粉酶催化部位一个或多个氨基酸通过PCR或化学全合成的方法进行替换。具体而言，是以SEQ ID NO.1为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合。所述制备所述淀粉酶突变体的方法，具体步骤如下I)根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQ ID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pAmyQ (附图说明图1)；2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌淀粉酶(SEQ ID NO.1)进行模拟，获得淀粉酶空间结构；3)通过对淀粉酶的氨基酸序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位占.4)设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；5)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。表I淀粉酶突变引物序列权利要求1.一种热稳定提高的淀粉酶突变体，其特征在于以SEQ ID NO.1所示序列为出发序列， 将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合得到的突变体。2.权利要求1所述的淀粉酶突变体，其特征在于第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸。3.权利要求2所述的淀粉酶突变体，其特征在于还将第467位脯氨酸替换成缬氨酸。4.权利要求1所述的淀粉酶突变体，其特征在于第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216 位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸。5.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的载体。6.能表达生产权利要求1所述淀粉酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系。7.权利要求1所述淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，将淀粉酶活性位点内的一个或多个氨基酸通过PCR或化学全合成的方法进行替换。8.权利要求7所述方法，其特征在于，以SEQID NO.1为出发序列，通过PCR或化学全合成的方法，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合。9.权利要求7或8所述方法，其特征在于，具体步骤如下1)根据嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列SEQID NO.1所示，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b (+)中，构建重组质粒；2)利用Swiss-model软件对源自嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)淀粉酶进行模拟，获得淀粉酶空间结构；3)通过对淀粉酶的序列以及空间结构进行分析，确定要突变的氨基酸位点；4)设计突变引物，对淀粉酶基因序列进行定点突变，将所述位点的氨基酸进行替换，获得含有突变淀粉酶序列的重组载体；5)将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得淀粉酶突变体。10.权利要求1-4任一所述淀粉酶突变体在纺织、洗涤剂、制革、造纸、医药、食品领域的应用。全文摘要本专利技术公布了一种热稳定性提高的淀粉酶突变体及其应用，属于遗传工程领域。本专利技术以嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)JN21(CCTCC NO:M 2011231)淀粉酶为母本，采用分子生物学技术对嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列进行定点突变。在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶在50°C的半衰期由对照(突变前)例的15.3min提高到43.8min。利用此策略可以显著提高淀粉酶的热稳定性，为其工业化生产提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。文档编号C12N15/10GK102994474SQ20121059320公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日专利技术者陈坚, 堵国成, 刘龙, 李江华, 杨海泉, 邓壮梅 申请人:江南大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种热稳定提高的淀粉酶突变体，其特征在于以SEQ?ID?NO.1所示序列为出发序列，将第58位脯氨酸替换成丙氨酸、第199位组氨酸替换成亮氨酸、第216位谷氨酰胺替换成缬氨酸、第292位天冬酰胺替换成色氨酸、第467位脯氨酸替换成缬氨酸或其任意组合得到的突变体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，刘龙，李江华，杨海泉，邓壮梅，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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