本发明专利技术公开了一种高催化效率碱性淀粉酶突变体及其制备方法和应用，属于遗传工程领域。本发明专利技术以嗜碱芽孢杆菌（Bacillus?alcalophilus）JN21(CCTCC?NO:M2011231)淀粉酶为母本，采用分子生物学技术对嗜碱芽孢杆菌淀粉酶序列进行短肽融合表达。在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶比酶活比对照（突变前）例的比酶活提高4.1倍；催化效率比对照（突变前）例的催化效率提高3.5倍。利用此策略可以大大提高淀粉酶的催化效率，为其在纺织退浆、洗涤剂添加剂等工业生产领域提供了基础。此策略对淀粉酶及其它酶的催化效率提高具有重要的指导意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高催化效率淀粉酶突变体及其制备方法。
技术介绍
α-淀粉酶（EC3.2.1.1）是一种降解淀粉的重要的工业用酶，主要应用在食品、纺织、医药、洗涤剂等领域。耐氧化性淀粉酶可用于纺织品退浆、洗涤剂添加剂以及以淀粉作粘结剂的粘度调节剂等。Horikoshi在1971年首先报道了产自嗜碱菌A-40-2的碱性淀粉酶。2007年Saxena等人筛选到一株可以产碱性淀粉酶的菌株。2010年Pancha等（Pancha I,Jain D,ShrivastavA,Mishra S,Shethia B,Mishra S,VP M,Jha B.A thermoactive[alpha]-amylase from a Bacillus sp.isolated fromCSMCRI salt farm.International Journal of Biological Macromolecules,2010,47(2):288-291.）筛选出一株产耐温淀粉酶菌株。目前，国内的前处理酶制剂市场基本被丹麦诺维信公司和美国杰能科公司所垄断。诺维信公司介绍了一种淀粉酶，有较宽的pH及温度范围。具有耐化学氧化性的淀粉酶主要应用于洗涤剂添加剂和纺织退浆一浴法等工业中。但耐氧化性淀粉酶的工业化生产并没有报道。耐氧化性淀粉酶生产菌株的获得主要通过筛选、诱变和酶分子改造获得。筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株。诱变包括：自然突变和诱变，自然突变的几率相当小，诱变的工作量较大且不可控出现负突变的几率较大。酶分子改造目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，达到耐氧化性的目的。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高催化效率淀粉酶突变体，是淀粉酶的N端区域与短肽通过PT-linker连接得到的突变体。所述短肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述PT-linker序列如SEQ ID NO.3所示。本专利技术还是提供一种制备所述淀粉酶突变的方法，其技术方案如下：1）据短肽序列，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pET-22b(+)-P；2）根据嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）的淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成；3）针对已分析序列设计引物，将全合成的淀粉酶序列克隆到重组质粒pET-22b(+)-P中，构建含有短肽和淀粉酶片段的重组质粒pAAQ-P，将短肽融合到碱性淀粉酶的N-端，获得含有突变淀粉酶序列与短肽序列融合状态的重组载体；4）将突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得突变株。5）测定突变株表达淀粉酶的催化效率。本专利技术提供的淀粉酶突变体催化效率高，在此改造条件下，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶比酶活比对照（突变前）例的比酶活提高4.1倍；催化效率比对照（突变前）例的催化效率提高3.5倍。相对于采用筛菌或诱变等手段，缩短了酶学性质改造时间。将该高催化效率淀粉酶突变体应用于纺织退浆、洗涤剂添加等领域，可以在高效降解淀粉，具有广阔的应用前景。附图说明图1：pAAQ-P的质粒图谱。图2：淀粉酶3D空间结构。具体实施方式实施例1：淀粉酶高催化效率提高突变分析与方法通过对淀粉酶3D空间结构（图2）进行分析，确定区域A（催化区域）、区域B、区域C。同时，对催化区域（催化区域）进行分析发现3个活性位点（Asp238,Glu268,Asp330）。根据淀粉酶的氨基酸序列及结构相关性，选用短肽与碱性淀粉酶序列进行融合表达，提高其催化效率。据短肽序列，采用化学全合成的方法全合成后克隆到质粒pET-22b(+)中，构建重组质粒pET-22b(+)-P。进而根据嗜碱芽孢杆菌（Bacillus alcalophilus）的淀粉酶序列，采用化学全合成的方法全合成。针对已分析序列设计引物，将全合成的淀粉酶序列克隆到重组质粒pET-22b(+)-P中，构建含有短肽和淀粉酶片段的重组质粒pAAQ-P，将短肽融合到碱性淀粉酶的N-端，获得含有突变淀粉酶序列与短肽序列融合状态的重组载体。突变后重组载体转化大肠杆菌BL21，诱导表达，获得突变株。将重组质粒转化大肠杆菌宿主BL21，进行诱导表达，获得耐氧化性突变后的重组淀粉酶。实施例2：融合前后淀粉酶比酶活力测定DNS法测定碱性淀粉酶酶活1）DNS试剂的配置：称取2.5g3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入0.5g苯酚，再溶解0.075g亚硫酸钠、2.5g氢氧化钠、50g酒石酸钾钠，将其转入500mL容量瓶中摇匀定容，储存于棕色瓶放置在4°C冰箱中待用。2）麦芽糖标准曲线的制作：配制0.2g/L-1.0g/L不同浓度的麦芽糖溶液。取1mL不同浓度的麦芽糖与同体积的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴10min。用冷水冷却，定容至10mL，A540测定吸光值。以麦芽糖的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，制作标准曲线。3）将2mL1%的可溶性淀粉加入到试管中，加入1mL的缓冲液，混匀，55°C预热5min，加入0.4mL稀释好的酶液，反应5min。取1mL反应液与同体积的DNS试剂混匀，沸水浴煮沸10min，用冷水冷却，定容至10mL，混匀后，以没有加酶液但加入当量的去离子水的反应体系作为对照，测定A540吸光值。淀粉酶比酶活力测定将碱性淀粉酶纯化后，利用Bradford方法测定纯化后融合前后淀粉酶的蛋白浓度。将测定蛋白浓度的淀粉酶，利用3）方法测定酶活力。利用酶活力单位与淀粉酶蛋白浓度相比较，获得淀粉酶的比酶活。融合后，嗜碱芽孢杆菌淀粉酶比酶活比对照（突变前）例的比酶活提高4.1倍。该淀粉酶催化效率获得极大提高，在可以更高效降解淀粉。酶活力单位定义：在pH10.0,温度55°C,在1min降解可溶性淀粉产生1μg还原物质（以麦芽糖计算）所需要的酶量，为1个酶活单位（U）。实施例3：融合前后淀粉酶催化效率测定将融合短肽后的重组淀粉酶纯化后，采用pH10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，将缓冲液与可溶性淀粉混匀，采用3）的方法测定淀粉酶酶活力。将碱性淀粉酶纯化后，利用Bradford方法测定纯化后融合前后淀粉酶的蛋白浓度。利用Eadie-hofstee曲线方法，确定碱性淀粉酶的最大反应速率Vmax。将于酶对应的蛋白浓度进行相比，获得淀粉酶的催化效率常数（kcat）。短肽融合后，催化效率比对照（突变前）例的催化效率（kcat）提高3.5倍。该淀粉酶催化效率获得极大提高，在可以高效降解淀粉。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高催化效率碱性淀粉酶突变体，其特征在于，是淀粉酶的N端区域与短肽通过PT？linker连接得到的突变体。
【技术特征摘要】
1.一种高催化效率碱性淀粉酶突变体，其特征在于，是淀粉酶的N端区域与短肽通过
PT-linker连接得到的突变体。
2.权利要求1所述突变体，其特征在于，所述短肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述突变体，其特征在于，所述淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种高催化效率碱性淀粉酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的
淀粉酶N端区域与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的短肽通过PT-linker连接得到的
突变体。
5.权利要求1-4任一所述突变体，其特征在于，所述PT-linker序列如SEQ ID NO.3所示。
6.一种制备权利要求1所述淀粉酶突变的方法，其特征在于，步骤如下：
【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，堵国成，刘龙，李江华，杨海泉，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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