耐热植酸酶及其基因的克隆和表达制造技术

本发明专利技术公开了一种耐热植酸酶及其基因的克隆和表达。解决了现有植酸酶耐温性较差及营养无利用流失和必须营养的“添加浪费”等问题。技术方案：筛选耐热性植酸酶天然菌株，利用分子生物学的手段，将编码此产物的基因进行基因克隆；该基因全长１１５２核苷酸，编码３８３个氨基酸；Ｎ端的２６个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在＋２６位的丙氨酸之后；构建耐热植酸酶基因的工程菌株ＳＤＬｉｕＴＰ０１，表达基因产物。本发明专利技术的耐热植酸酶在较宽温度范围内具有生物活性、能促进植物生长、增加土壤肥力、不破坏农作物品质；降解食品和饲料中的不溶性磷、提高磷的利用、减少有机磷对环境的污染。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种植酸酶，特别涉及一种植酸酶及其基因的克隆和表达。
技术介绍
长期以来，农村广泛使用化肥，化肥可以增加土壤肥力，但连续使用化肥，肥效日减，不得不加大施肥量。而过量施用化肥，则会造成土壤板结，地力减弱，还破坏农作物品质。同时造成化学残留公害，污染环境(如水体富营养化)，导致恶性循环，危及子孙后代。在七十年代，国际上成立了“有机农业联盟”，在世界范围呼吁不用或尽量少用化肥，大力提倡使用有机肥料。在这种共识下，世界各国均在努力以生物菌肥来取代化肥。现美国已有5％的农场发展为不用化肥和农药的无化学农场。德国正在鼓励和发展不用化肥，已有3％的农田采用生态农业模式。前苏联也有1/2豆类农作物使用微生物肥料。现有生物肥料的活性大多是矿化不溶性无机磷和部分有机磷。使耕层土壤中的无效磷成为植物可以利用的磷营养。耕层土中的磷15％--95％为有机形态。其中大量有机磷以植酸的形式存在。特别是提倡秸杆还田和使用粪肥以后，更多的植酸被带入耕层。许多研究表明决定磷对植物的有效性的主要因素不是土壤内有机磷的含量，而是矿化速率。植酸酶的作用底物是植酸及其盐类，它能释放出有效磷。然而，植物所编码的植酸酶是非分泌型的，由于缺少胞外植酸酶活力，植物对于土壤中有机磷的主要成分植酸的利用率很低。自然状态下由某些微生物产生的植酸酶(3-肌醇六磷酸酶，Myo-Inositol-hexaphosphate 3-phosphohydrolase)可作用于酯键，催化磷酸单酯水解，能将植酸水解为肌醇和无机磷。具体反应为 同时植酸酶是一种能将饲料中植酸水解成无机磷和肌醇的新型单胃动物饲料添加剂，这是当前世界性的研究热点之一。磷在植物中主要以植酸(肌醇六磷酸)及其盐类的形式存在。它们在植物和油料作物种子中的含量占干重的1％-3％，但却贮存着植物中总磷的60％-90％，是种子萌发所需磷的主要来源。动物所需的磷主要从植物中获取。动物的生长、繁殖、骨骼矿化及代谢都需要磷。然而，在人和单胃动物的食物中，来源于植物的植酸具有强烈的抗营养作用。美国肯塔基大学通过10年研究证实，猪只能利用玉米中磷的10％-20％，豆饼中磷的15％-35％，而鸡对玉米和豆粕中磷的利用率比猪还低。由此可见，食物中85％左右的磷未能有效吸收就从粪便中排出。磷作为一种必须的矿物营养素在动物营养中具有重要作用。为预防磷缺乏病，又必须在食物或饲料中添加无机磷酸盐，以满足畜禽对磷的需求，因此，造成磷酸的严重浪费。人类营养学家研究表明，植酸的这种性质也导致了人类钙、锌、铁、钾的缺乏和数量不平衡。由于植酸的抗营养作用造成了食物利用率低下、营养无利用流失和必须营养的“添加浪费”现象，也是一直困扰食品和饲料工业的一大难题。植酸酶可解除植酸的抗营养作用，提高食品及饲料中矿物元素和蛋白质的营养有效性以及能量平衡能力。Nayini等(1983)证明，添加植酸酶经过约2小时发酵后，植酸盐含量可降低58％-70％。植酸酶能从植酸分子上将磷酸水解下来，破坏了它对矿物质和蛋白质的亲和力，从而提高矿物质的营养有效性和蛋白质的消化率；同时可使一些酶如淀粉酶等恢复其原有的活性，提高了食品和饲料的能量有效性。Simons等将植酸酶添加到鸡饲料中，饲喂肉用仔鸡，试验表明，添加植酸酶可使磷的利用率提高60％，粪便中磷排出量减少40％，显著提高了肉仔鸡的增重量和饲喂效果。由此可见，在讲究膳食营养和注重饲料利用率的今天，研究和利用植酸酶具有相当重要的意义。然而，植酸酶应用于农业及食品和饲料添加剂，需要进行工业化加工和处理，为此，要求植酸酶在经过较高温度的工艺加工和处理后，仍能保持较高的生物活性。而现有的植酸酶其耐温性较差，使植酸酶在农业及食品和饲料添加剂领域的应用受到制约。
技术实现思路
本专利技术是针对上述问题进行的研究，目的是筛选一种可产生耐热植酸酶的菌株，利用分子生物学的手段，将编码此产物的基因进行基因克隆和表达；提供一种经过较高温度的工艺加工和处理后仍具有生物活性的耐热植酸酶。本专利技术的技术方案是筛选一种可产生耐热植酸酶的天然菌株，并从菌株中提取基因DNA，采用PCR方法(ManiatisT.，et al.Molecular cloning.New Yorkcold spring harberlaberalory，1982)扩增出耐热植酸酶基因。利用连接酶将此基因连接于克隆载体pMD18-T上，转化大肠杆菌，检出阳性克隆。对于阳性克隆所携带目的基因进行全序列分析。耐热植酸酶基因DNA序列为S1，由DNA序列推导出氨基酸序列为S2。<110>天津师范大学<120>耐热植酸梅及其基因的克隆和表达<160>1200<211>383 <212>DNA<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)<400>1S1NewSequence SequenceATGAATCATT CAAAAACACT TTTGTTAACC GCGGCAGCCG GATTGATGCT 50CACATGCGGT GCGGTTTCTT CCCAGGCCAA GCATAAGCTG TCTGATCCTT 100ATCACTTTAC CGTGAATGCG GCGGCGGAAA CGGAGCCGGT TGATACAGCC 150GGTGATGCAG CTGATGATCC TGCGATTTGG CTGGACCCCA AGAATCCTCA 200GAACAGCAAA TTGATCACAA CCAATAAAAA ATCAGGCTTA GTCGTGTACA 250GCCTAGAGGG AAAGACGCTT CATTCCTATC ATACCGGGAA GCTGAACAAT 300GTTGATATCC GCTATGATTT TCCGTTGAAC GGAAAAAAAG TCGATATTGC 350GGCGGCATCC AATCGGTCTG AAGGAAAGAA TACCATTGAG ATTTACGCCA 400TTGACGGGAA AAACGGCACA TTACAAAGCA TTACAGATCC AGACCGCCCG 450ATTGCATCAG CAATTGATGA AGTATACGGT TTCAGCTTGT ACCACAGTCA 500AAAAACAGGA AAATATTACG CGATGGTGAC AGGGAAAGAA GGCGAATTTG 550AACAATACGA ATTAAATGCG GATAAAAATG GATACATATC CGGCAAAAAG 600GTAAGGGCGT TTAAAATGAA TTCTCAGACA GAAGGGATGG CAGCAGACGA 650TGAATACGGC AGTCTTTTAT TCGCAGAAGA AGATGAGGCC ATCTGGAAGT 700TCAGCGCTGA GCCGGACGGC GGCAGTAACG GAACGGTTAT CGATCGTGCC 750GACGGCAGGC ATTTAACCCC TGATATTGAA G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐热植酸酶基因，其特征是耐热植酸酶基因全长１１５２核苷酸，该基因编码３８３个氨基酸，Ｎ端的２６个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在＋２６位的丙氨酸之后，其基因的ＤＮＡ序列为Ｓ１，由ＤＮＡ序列推导出氨基酸序列为Ｓ２：Ｓ１ＮｅｗＳｅｑｕｅｎｃｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡＴＧＡＡＴＣＡＴＴ　ＣＡＡＡＡＡＣＡＣＴ　ＴＴＴＧＴＴＡＡＣＣ　ＧＣＧＧＣＡＧＣＣＧ　ＧＡＴＴＧＡＴＧＣＴ　５０ＣＡＣＡＴＧＣＧＧＴ　ＧＣＧＧＴＴＴＣＴＴ　ＣＣＣＡＧＧＣＣＡＡ　ＧＣＡＴＡＡＧＣＴＧ　ＴＣＴＧＡＴＣＣＴＴ　１００ＡＴＣＡＣＴＴＴＡＣ　ＣＧＴＧＡＡＴＧＣＧ　ＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡ　ＣＧＧＡＧＣＣＧＧＴ　ＴＧＡＴＡＣＡＧＣＣ　１５０ＧＧＴＧＡＴＧＣＡＧ　ＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣ　ＴＧＣＧＡＴＴＴＧＧ　ＣＴＧＧＡＣＣＣＣＡ　ＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡ　２００ＧＡＡＣＡＧＣＡＡＡ　ＴＴＧＡＴＣＡＣＡＡ　ＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡ　ＡＴＣＡＧＧＣＴＴＡ　ＧＴＣＧＴＧＴＡＣＡ　２５０ＧＣＣＴＡＧＡＧＧＧ　ＡＡＡＧＡＣＧＣＴＴ　ＣＡＴＴＣＣＴＡＴＣ　ＡＴＡＣＣＧＧＧＡＡ　ＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴ　３００ＧＴＴＧＡＴＡＴＣＣ　ＧＣＴＡＴＧＡＴＴＴ　ＴＣＣＧＴＴＧＡＡＣ　ＧＧＡＡＡＡＡＡＡＧ　ＴＣＧＡＴＡＴＴＧＣ　３５０ＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣ　ＡＡＴＣＧＧＴＣＴＧ　ＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡ　ＴＡＣＣＡＴＴＧＡＧ　ＡＴＴＴＡＣＧＣＣＡ　４００ＴＴＧＡＣＧＧＧＡＡ　ＡＡＡＣＧＧＣＡＣＡ　ＴＴＡＣＡＡＡＧＣＡ　ＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣ　ＡＧＡＣＣＧＣＣＣＧ　４５０ＡＴＴＧＣＡＴＣＡＧ　ＣＡＡＴＴＧＡＴＧＡ　ＡＧＴＡＴＡＣＧＧＴ　ＴＴＣＡＧＣＴＴＧＴ　ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＡ　５００ＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡ　ＡＡＡＴＡＴＴＡＣＧ　ＣＧＡＴＧＧＴＧＡＣ　ＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡ　ＧＧＣＧＡＡＴＴＴＧ　５５０ＡＡＣＡＡＴＡＣＧＡ　ＡＴＴＡＡＡＴＧＣＧ　ＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧ　ＧＡＴＡＣＡＴＡＴＣ　ＣＧＧＣＡＡＡＡＡＧ　６００ＧＴＡＡＧＧＧＣＧＴ　ＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡ　ＴＴＣＴＣＡＧＡＣＡ　ＧＡＡＧＧＧＡＴＧＧ　ＣＡＧＣＡＧＡＣＧＡ　６５０ＴＧＡＡＴＡＣＧＧＣ　ＡＧＴＣＴＴＴＡＴＡ　ＴＣＧＣＡＧＡＡＧＡ　ＡＧＡＴＧＡＧＧＣＣ　ＡＴＣＴＧＧＡＡＧＴ　７００ＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡ　ＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣ　ＧＧＣＡＧＴＡＡＣＧ　ＧＡＡＣＧＧＴＴＡＴ　ＣＧＡＴＣＧＴＧＣＣ　７５０ＧＡＣＧＧＣＡＧＧＣ　ＡＴＴＴＡＡＣＣＣＣ　ＴＧ...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽丽，陈立新，杨文博，
申请(专利权)人：天津师范大学，天津市农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]