青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子（BAFF）基因与蛋白制备技术，涉及青石斑鱼BAFF基因克隆、表达、蛋白纯化及活性鉴定技术。通过RT-PCR和RACE技术我们得到了青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子的全长cDNA。它具有SEQIDNO.1所示的序列，该基因CDS开放阅读框碥码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。将胞外功能区可溶段连接到pET28a原核质粒中并转到大肠杆菌BL21(DE3)中表达，Ni+-NTA柱纯化后得到的重组蛋白His6-EasBAFF，实验证明该融合蛋白能够明显促进青石斑鱼淋巴细胞以及小鼠B淋巴细胞的存活。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物基因工程领域，具体涉及青石斑鱼BAFF基因克隆、表达、蛋白纯化及活性鉴定技术。
技术介绍
肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员生物学效应包括促进细胞生长、分化、凋亡及炎症诱发等功能，在淋巴器官的形成，免疫细胞的激活及维持机体的稳态方面发挥重要的生物学作用。近年来，很多具有重要功能的TNFSF被发现，B淋巴细胞刺激因子 (B lymphocyte stimulator, BLyS),又称 TALL-I(TNF-and ApoL-related leukocyteexpressed ligand I)、BAFF(B cell activating factor belonging to the TNF family)、THANK (TNF homologue that activates apoptosis、NF_KB and JNK),属于肿瘤坏死因子(TNF)家族，有研究表明人体内BAFF的水平对维持机体免疫系统的“稳态”(homeostasis)非常重要，人BAFF表达缺陷将极大地降低人体免疫力，BAFF作为在人体免疫系统中起重要调控作用的一种特异的细胞因子，其活性的充分表达能够很好地加强机体的自身免疫能力，直接或间接地提高体内BAFF的水平将有助于对免疫缺陷疾病进行治疗，BAFF的重大理论意义和临床医学应用价值在国际上引起了高度重视。鉴于鱼类所处的进化地位以及水产养殖业的高速发展，鱼类免疫系统日益为人所关注。对鱼类免疫系统的研究不仅为高等生物免疫演化途径提供重要的参考，同时也为日趋严重的鱼类养殖的病害防治提供必要的免疫理论与应用基础。鱼类与哺乳动物在免疫器官组成上不同，肾脏和脾脏是其主要的免疫器官，因此，我们推测与免疫相关的细胞因子TNF家族的成员在鱼类免疫中有重要作用。石斑鱼是重要的世界性海产经济鱼类，本课题基于国内外研究的现状以及石斑鱼的细菌感染相关疾病的思考，提出对石斑鱼BAFF基因进行分子结构、功能及免疫调节机制方面进行研究，针对免疫力低下和炎症感染疾病的鱼类，有望开发成相关的免疫增强剂和疫苗佐剂。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种从中青石斑鱼中获得B淋巴细胞刺激因子(BAFF) cDNA,并提供青石斑鱼BAFF蛋白的表达及纯化方法和活性检测。本专利技术所述青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子(BAFF) cDNA，序列如SEQ ID NO. I所示 青石斑鱼BAFF cDNA的克隆方法如下 (1)提取青石斑鱼脾脏组织总RNA，SMART RACE试剂盒(TaKaRa)逆转录为第一链cDNA ； (2)设计引物扩增该基因的中间片段正义寡核苷酸引物Ea-M-F :5’ - TCAGAGGTGTGTCGCAGGAGA -3’ (SEQ ID NO. 5) 反义寡核苷酸引物=Ea-M-R :5，- TCCTGTGAAGCAGGTGTTGTA -3，(SEQ ID NO. 6)(3)根据中间片段序列设计引物扩增该基因的3’端 3’端正义寡核苷酸外引物GSP-U3’ 5’-GATGCGTTGACCCTGACAAG GAATAGA AGG-3’ (SEQID NO. 7) 3’端正义寡核苷酸内引物GSP-N3’ 5’-GGCAGGCTGGGCTGA GGAGAGGCTCT-3’ (SEQ IDNO. 8)3’ 端反义寡核苷酸引物UPM 5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (SEQ ID NO. 9) (4)根据中间片段序列设计引物扩增该基因的5’端 5’ 端正义寡核苷酸引物UPM 5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ (SEQ ID NO. 9) 5’ 端反义寡核苷酸外引物GSP-U5’ 5’ -AGGGGATACCTGTGTGTG GCTCCGACTT-3’ (SEQID NO. 10) 5’端反义寡核苷酸内引物GSP-N5’ 5’-GAGTCCCAGGTTGG TGCAGAGGCTCTT-3’ (SEQ IDNO. 11) (5)用上述引物PCR，我们得到该基因的中间片段、3’端和5’端PCR产物。将上述引物的PCR扩增产物，克隆入PMD-19T载体，并进行测序碱基序列测定。根据中间片段与3’端以及中间片段与5’端之间的重复部分将这三段拼接起来，拼接后我们得到了青石斑鱼BAFF基因的全长cDNA序列。对该基因开放阅读框(OFR)分析表明，该基因氨基酸序列具有TNF家族基因的共有特征，一个跨膜区、一个弗林酶切位点、三个保守的半胱氨酸残基以及3D结构显示出的BAFF特有的“D-E Loop”。讲该基因序列与其它已知物种BAFF序列比对，该基因核苷酸序列与人、斑马鱼、鲈鱼的相似性分别是45. 48%,60. 81%,84. 8%，青石斑鱼与同属于鲈形目的鲈鱼相似度是最高的。本专利技术还公开了青石斑鱼BAFF全长⑶S序列，其碥码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。基因胞外功能区核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示。以及该基因编码的胞外功能区氨基酸序列，如SEQ ID NO. 4所示。对该基因的进一步研究表明；该基因主要表达于青石斑鱼主要免疫器官脾脏及肾脏中，通过现有基因工程方法将该基因的胞外功能区克隆连接到pET28a原核质粒中并转到大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，本专利技术通过多次预表达实验摸索出了合适的表达条件(调节IPTG的浓度、温度及转速使融合蛋白尽可能多的以可溶形式表达)，超声破碎后离心收集上清过Ni+-NTA柱纯化，梯度洗脱之后我们得到了青石斑鱼BAFF胞外功能区融合蛋白(His6-EasBAFF)。并进行Western-blot鉴定。体外WST-8染料生物活性检测结果显示，该蛋白不仅能促进青石斑鱼淋巴细胞的存活，对小鼠B淋巴细胞也有明显的促存活效应，且呈现剂量依赖效应。附图说明图I pET28a_EasBAFF表达载体的构建。图2 SDS-PAGE分析His6-EasBAFF在大肠杆菌中的表达。I重组蛋白非诱导；2重组蛋白诱导22 h ；3纯化后蛋白His6-EasBAFF ;4western blotting 鉴定结果。图3 WST-8染料检测His6-EasBAFF对青石斑鱼淋巴细胞的促存活作用。图4 WST-8染料检测His6-EasBAFF对小鼠B淋巴细胞的促存活作用。具体实施例方式在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。 下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本专利技术。应理解，这些实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本专利技术的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例I青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子(BAFF)全长cDNA的获得，青石斑鱼购自南京惠民桥市场。(I) 提取总RNA :应用RNA抽提试剂盒(TIANGEN)按照其操作手册提取青石斑鱼脾脏组织总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳本文档来自技高网...
【技术保护点】
青石斑鱼B淋巴细胞刺激因子基因cDNA，其特征在于，它的序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张双全，田爱英，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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