桔小实蝇Taiman基因和其qRT-PCR检测方法以及其siRNA技术

本发明专利技术公开了一种桔小实蝇Taiman基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；提供如SEQ ID NO:15所示的桔小实蝇Taiman基因的siRNA，序列如SEQ ID NO:25所示；还提供对SEQ ID NO:15所示的基因进行qRT‑PCR检测的方法，qPCR中的使用的上、下游引物为序列分别如SEQ ID NO:37、38所示；还提供了如SEQ ID NO:25所示的siRNA在桔小实蝇发育、变态与生殖调节方面的应用，在桔小实蝇防治上的应用，或者在制备桔小实蝇杀虫剂方面的应用。解决了桔小实蝇目前没有有效的Taiman基因的siRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。

Detection of Taiman gene and the qRT on PCR and siRNA

The invention discloses a Taiman gene, the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:15; siRNA Taiman SEQ ID fly genes such as NO:15 shown in the sequence as shown in SEQ ID NO:25; also shown on SEQ ID NO:15 gene qRT PCR test, the use of qPCR in the upstream and downstream primers for sequences such as SEQ ID NO:37, shown in Figure 38; also provides siRNA such as SEQ ID NO:25 shown to regulate the application in the development, metamorphosis and reproduction of Bactrocera dorsalis, used in control, or by application of Bactrocera dorsalis in the process of preparing pesticides. To solve the problem of its currently no siRNA Taiman gene of the effective, has a good application prospect in the development of new pesticides.

【技术实现步骤摘要】
桔小实蝇Taiman基因和其qRT-PCR检测方法以及其siRNA
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及桔小实蝇Taiman基因和其qRT-PCR检测方法以及其siRNA。
技术介绍
桔小实蝇(Bactroceradorsalis)作为我国重要的检疫性害虫，在水果和蔬菜产业方面的危害最为严重，也被认为是我国国际贸易中农产品出口和国内农业的可持续发展中重要的制约因子。桔小实蝇以其寄主范围广、繁殖能力强和世代重叠的特点，使防治的难度大大加大。近年来，主要使用化学防治的方法对于桔小实蝇的治理，虽然简单方便，但长期使用单一药剂，抗药性日益上升为亟待解决的问题。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA，Double-strandedRNA，双链核糖核酸)诱发的、同源RNA高效特异性降解的现象，是通过dsRNA的介导特异性的降解对应序列的mRNA。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和基因治疗领域。保幼激素(Juvenilehormone,JH)是调控昆虫发育、变态与生殖最重要的激素之一。在昆虫幼虫期，JH阻止由蜕皮激素(Ecdysone)引起的变态，从而使幼虫蜕皮后仍然维持幼虫形态。在幼虫最后一次蜕皮前，JH滴度降低或缺失，导致全变态昆虫化蛹和不完全变态昆虫羽化为成虫。保幼激素在全变态和不全变态昆虫生长发育变态过程中不可或缺，所以保幼激素信号通路Taiman基因的功能研究有利于我们了解保幼激素作用机理。由于人类、高等动物、植物并不含有保幼激素，故保幼激素信号通路基因作为害虫的靶标相对安全，基于该途径研发的新型杀虫剂，应用于害虫的防治具有很大的潜力，但是目前针对桔小实蝇保幼激素通路Taiman基因的相关研究较少，也未见针对桔小实蝇保幼激素信号通路Taiman基因的dsRNA的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种桔小实蝇Taiman基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:15所示。在本专利技术的第一方面，提供一种如SEQIDNO:15所示的桔小实蝇Taiman基因的siRNA，序列如SEQIDNO:25所示。在本专利技术的另一方面，提供一种对SEQIDNO:15所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，qPCR中的使用的上、下游引物为BdTaiE-F、BdTaiE-R，其序列分别如SEQIDNO:37、38所示。在上述qRT-PCR检测的方法中，PCR反应体系为20μl，包括：cDNA模板1μl，上、下游qPCR引物各1μl，去核酸酶水7μl和荧光染料qPCRMasterMix10μl。在上述qRT-PCR检测的方法中，qRT-PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃变性30s、60℃退火30s，共40个循环。本专利技术还提供了如SEQIDNO:25所示的siRNA在桔小实蝇发育、变态与生殖调节方面的应用，在桔小实蝇防治上的应用，或者在制备桔小实蝇杀虫剂方面的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术运用PCR技术克隆获得桔小实蝇保幼激素信号通路Taiman基因的可变剪切体，并根据该序列得到Taiman基因的siRNA，可以应用于对桔小实蝇进行RNA干扰从而起到防治桔小实蝇的效果。通过实验验证，siRNA-Tai-E基因沉默效率高，基因干扰后桔小实蝇有明显表型变化，解决了桔小实蝇目前没有有效的保幼激素信号Taiman基因的siRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。附图说明图1为扩增桔小实蝇Taiman基因得到的5个可变剪切体进行氨基酸序列相似性比对结果图。图2为桔小实蝇的Taiman基因的氨基酸系统发育树。图3为桔小实蝇注射dsRNA后Taiman基因或注射siTaiman-E后Taiman-E基因的qRT-PCR检测结果，其中A、B为注射dsRNA，C、D为注射siTaiman-E。图4为桔小实蝇注射dsRNA或siTaiman-E后幼虫化蛹时间变化统计图，其中，A为注射dsRNA，B为注射siTaiman-E。图5为桔小实蝇注射dsRNA或siTaiman-E后蛹的表型，其中，A、C、E为注射dsRNA后的蛹的表型，B、D、F为注射siTaiman-E后的蛹的表型。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。主要试剂及生产者：PrimeSTARMaxPremix、PrimeSTARMaxPremix、胶回收纯化试剂盒、PerfectrealtimeRTreagent(Takara公司,日本)TRIzolkit(Invitrogen公司，美国)RNeasyPlusMicroKit(QIAGEN公司，德国)TranscriptAidT7HighYieldTranscriptionKit、TranscriptAidEnzymeMix、ATP/CTP/GTP/UTPMix、PrimeScriptRTEnzymeMixI、OligodTPrimer(ThermofisherScientific公司，美国)qPCRMasterMix(Promega公司，美国)实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一、桔小实蝇Taiman基因可变剪切体序列克隆按照如下步骤操作：1)利用RNA提取试剂盒RNeasyPlusMicroKit按照使用说明提取桔小实蝇的总RNA，然后利用反转录试剂盒PerfectrealtimeRTreagent按照使用说明将1μg总RNA反转录成为cDNA。2)以上述得到的cDNA为模板，根据NCBI上预测的桔小实蝇Taiman基因序列以及该基因保守结构序列，分段设计全长扩增引物，共设计了5对分段扩增引物进行全长扩增：BdTaiS1-F/BdTaiS1-R，BdTaiS2-F/BdTaiS2-R，BdTaiS3-F/BdTaiS3-R，BdTaiS4-F/BdTaiS4-R，BdTaiS5-F/BdTaiS5-R。PCR条件为：98℃预变性3min；98℃变性30s、60℃退火15s、72℃延伸2min，共35个循环；72℃条件下延伸10min。PCR反应体系共25μl，包括：浓度为1000ng/μl的cDNA模板1μl，浓度为0.15-0.25μM的前述上、下游引物各1μl，primeSTARMaxPremix12μl以及去核酸酶水10μl。前述5对分段扩增引物的序列如下：BdTaiS1-F：5’-GTGTAATCCTGGGCAGAAACG-3’(如SEQIDNO:1所示)，BdTaiS1-R：5’-ACCGCTACCACAACCAATGTC-3’(如SEQIDNO:2所示)，BdTaiS2-F：5’-AATAATATGCCGTATGGAGTTAGCG-3’(如SEQIDNO:3所示)，BdTaiS2-R：5’-CACTTATGCTGCTACTGCTGTTT-3’(如SEQIDNO:4所示)，BdTaiS3-F：5’-CCTTCGCCTCAGTCAAATACA-3’(如SEQIDNO:5所示)，BdTaiS3-R：5’-CAGTGGGAGTAGGTGCTGATACA-3’本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桔小实蝇Taiman基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

【技术特征摘要】
1.一种桔小实蝇Taiman基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO:15所示。2.一种权利要求1所述的桔小实蝇Taiman基因的siRNA，其特征在于，序列如SEQIDNO:25所示。3.一种对SEQIDNO:15所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方法，其特征在于，qPCR中的使用的上、下游引物为BdTaiE-F、BdTaiE-R，其序列分别如SEQIDNO:37、38所示。4.如权利要求3所述的对SEQIDNO:15所示的桔小实蝇Taiman基因进行qRT-PCR检测的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：豆威，刘鸿，王进军，岳勇，牛金志，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50