一种细胞培养用微载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞培养用微载体及其制备方法，微载体包含质量百分比含量为聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～45％，丝素蛋白或胶原1～3％，微量元素0～2％的原料；由丝素蛋白或胶原涂布到聚苯乙烯、微量元素与聚乳酸合成的聚苯乙烯‑聚乳酸微粒表面制成。本发明专利技术微载体具有无毒性、无抗原性、细胞贴壁好、可降解等优点，并且生产过程简单，生产工艺容易实现。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞培养用微载体及其制备方法
本专利技术属于生物材料的组织工程
，尤其涉及一种细胞培养用微载体及其制备方法。
技术介绍
微载体培养技术是目前公认的最有发展前途的一种用于动物细胞大规模培养的技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易放大，条件可控。微载体将细胞固定在载体上生长，能最大限度地扩大比表面积，与其他方法相比，它的比表面积更大。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产疫苗、蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。自1962年Capstile成功地大规模悬浮培养BHK21细胞，以及1967年VanWezel首次成功应用微载体培养贴壁动物细胞以来，至今国际市场上出售的微载体商品类型已达十几种以上，其中常用的商品化微载体有三种：Cytodexl、2、3，Cytopore和Cytoline，目前最常使用的是Cytodexl、2、3型微载体。早期微载体多采用合成聚合物，如聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)、葡聚糖等。合成聚合物制备的微载体重复性和力学性能可以达到较高水平，但缺乏细胞识别位点，影响细胞在其表面粘附、生长。天然聚合物及其衍生物因其取材方便、生物相容性好且价格低廉，有望取代传统微载体制备材料。例如明胶、胶原、纤维素、甲壳素及其衍生物以及海藻酸钠等。胶原是一类可引导组织再生的生物材料，低抗原性、可参与组织愈合过程。Hillegas等(US4994388)在聚苯乙烯微球表面包覆一层胶原后表现出很好的效果。壳聚糖是甲壳质脱乙酰后的产物，其分子链之间可以形成许多氢键，分子中β-(1，4)糖苷键为其提供刚性和稳定性；氨基提供弱正电性；乙酰基提供疏水性；羟基具有良好的亲水性，但又不溶解于水。用壳聚糖制备的细胞培养微载体已有报道(TigliRSetal.，2009)。藻酸盐是带有二价阴离子的天然线性多糖，是由α-L-古洛糖醛酸和β-D甘露糖醛酸残基组成的共聚物。研究表明，培养在海藻酸盐载体上的软骨细胞可以合成与软骨材料相似的胞外基质(HauselmannHJ，1996)。除单种材料制备微载体外，还有两种及以上混合材料制备的微载体，如壳聚糖和明胶混合微载体(CN1321175C)，壳聚糖和多聚磷酸钠多孔微载体(CN101844059A)。天然聚合物材料在组织工程化微颗粒方面也有应用(CN101195044A)。将两种或两种以上材料混合制备微载体，可以克服单一材料的缺点，将几种材料的优势互补，并且能产生出新的功能，是将来微载体材料领域研究的方向之一。微载体的制备方法主要有相分离法、乳化-溶剂挥发法、冷冻法和喷雾法。其中，乳化-溶剂挥发法应用最为广泛，其法是将所用材料溶解在一种溶剂中，然后注入搅拌中的反相溶剂里乳化成所用材料的乳液，通过挥发掉原溶剂形成微载体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是：提供一种细胞培养用微载体,该微载体具有无毒性、无抗原性、细胞贴壁好、可降解等优点。本专利技术所要解决的第一个技术问题是：提供一种细胞培养用微载体的制备方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：一种细胞培养用微载体，包含质量百分比含量为聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～45％，丝素蛋白1～3％，微量元素0～2％的原料；由丝素蛋白涂布到聚苯乙烯、微量元素与聚乳酸混合成的聚苯乙烯-聚乳酸微粒表面制成。优选的，所述的微载体包含质量百分比含量为聚苯乙烯55％，聚乳酸42％，丝素蛋白2.0％，微量元素1.0％的原料。优选的，所述的丝素蛋白也可以由胶原来代替。优选的，所述的微量元素包含有甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯和过硫酸钾。一种细胞培养用微载体的制备方法，包括以下步骤：a.微量元素的配制：在40℃水中按照质量配比为100:40的比例加入甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯，搅拌升温至75℃，然后加入质量百分比为0.7％的过硫酸钾，反应8小时后停止反应，经破乳过滤洗涤干燥后备用；b.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制备：将质量百分比为聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～44％，微量元素0～2％；在分散机中混合，经喷雾干燥成微粒；c.丝素蛋白溶液的制备：将生蚕丝在碳酸钠溶液中煮沸，用去离子水清洗以去除丝胶蛋白，烘干，获丝素蛋白；将丝素蛋白溶解在氯化钙、水、乙醇摩尔比为1:8:2的溶液中用去离子水透析，过滤，制备出丝素蛋白的水溶液；将丝素蛋白水溶液搅拌浓缩，获得丝素蛋白溶液；d.微载体的生成：按质量配比将聚苯乙烯-聚乳酸微粒悬浮在酸性的含丝素蛋白溶液(0.01～0.1N乙酸)中，并将溶液蒸发至干；然后将干燥的丝素蛋白包被的聚苯乙烯-聚乳酸微粒悬浮在含有蛋白质交联剂(戊二醛)的磷酸盐缓冲盐溶液中，将丝素蛋白包被到聚苯乙烯-聚乳酸微粒上，制成微载体；然后将固定有丝素蛋白的聚苯乙烯-聚乳酸微粒在水中漂洗数次以除去未反应的戊二醛，最后将珠干燥、消毒并包装。优选的，所述的步骤b中分散机为高速分散机，分散时间为10分钟。优选的，所述的步骤b中喷雾干燥的进口温度为180～200℃，出口温度为60～90℃。优选的，所述的步骤d中交联剂选为戊二醛。优选的，所述的步骤d中所述微载体是以钴60γ射线辐照消毒。由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：1.克服了单纯的聚苯乙烯微载体的缺点，具有无毒性、无抗原性、细胞贴壁好、可降解等优点。2.因为丝素蛋白具备良好的生物相容性和降解缓慢的特性，以及在湿态下有着优良的力学性能，既可支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和功能，在动物细胞长时间高密度培养中有独特的作用，将丝素蛋白在微载体表面形成一层致密的壳层，加入一定浓度的戊二醛使其表面交联，可以用于所有贴壁细胞的大规模培养。3.本专利技术微载体尺寸均一、粒径可控，能够满足分离纯化、细胞培养微载体和诊断制剂等多方面的需求；4.本专利技术的各微载体之间没有合并现象，在保存过程中也不会出现并聚现象。5.该生产过程简单，生产工艺容易实现。具体实施方式下面结合实施例，进一步阐述本专利技术。实施例一：a.微量元素的配制：在40℃水中按照质量配比为100:40的比例加入甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯，搅拌升温至75℃，然后加入质量配比为0.7％的过硫酸钾，反应8小时后停止反应，经破乳过滤洗涤干燥后备用；b.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制备：将质量配比为聚苯乙烯50％，聚乳酸45％和步骤a得到的微量元素2.0％；在高速分散机中混合10分钟，经喷雾干燥成微粒；喷雾干燥的进口温度为180～200℃，出口温度为60～90℃；c.丝素蛋白溶液的制备：将75g生蚕丝在4L的5g/L的碳酸钠溶液中煮沸1小时，然后用大量去离子水清洗以去除丝胶蛋白，60～70℃下烘干，获丝素蛋白。将适量丝素蛋白在80±2℃下溶解在氯化钙/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，在室温条件下去离子水透析3d，去除溶液中的盐和乙醇，过滤去除不溶的杂质，制备出丝素蛋白的水溶液；将丝素蛋白水溶液在50±2℃、50～60转/分搅拌浓缩，获得浓度约7～10w/v％的丝素蛋白溶液；d.微载体的生成：将11.3公斤聚苯乙烯-聚乳酸微粒悬浮在5升7.0w/v％酸性的含丝素蛋白溶液中，并将溶液蒸发至干；然后将干燥的丝素蛋白包被的聚苯乙烯-聚乳酸微粒悬浮在含有蛋白质交联剂(如戊二醛)的磷酸盐缓冲盐溶液中，将丝素蛋白包被到聚苯乙烯-聚乳酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养用微载体，其特征在于：包含有质量百分比为聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～45％，丝素蛋白1～3％和微量元素0～2％的原料；由丝素蛋白涂布到聚苯乙烯、微量元素与聚乳酸混合成的聚苯乙烯‑聚乳酸微粒表面制成。

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养用微载体，其特征在于：包含有质量百分比为聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～45％，丝素蛋白1～3％和微量元素0～2％的原料；由丝素蛋白涂布到聚苯乙烯、微量元素与聚乳酸混合成的聚苯乙烯-聚乳酸微粒表面制成。2.如权利要求1所述的细胞培养用微载体，其特征在于：所述微载体包含有质量百分比为聚苯乙烯55％，聚乳酸42％，丝素蛋白2.0％和微量元素1.0％的原料。3.如权利要求1至2任一所述的细胞培养用微载体，其特征在于：所述丝素蛋白可替换为胶原。4.如权利要求3所述的细胞培养用微载体，其特征在于：所述微量元素包含有甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯和过硫酸钾。5.一种细胞培养用微载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：a.微量元素的配制：在40℃水中按照质量配比为100:40的比例加入甲基苯乙酸、丙烯酸正丁酯，搅拌升温至75℃，然后加入质量百分比为0.7％的过硫酸钾，反应8小时后停止反应，经破乳过滤洗涤干燥后备用；b.聚苯乙烯-聚乳酸微粒的制备：将质量百分比为聚苯乙烯50～60％，聚乳酸40～44％，微量元素0～2％的原料；在分散机中混合，经喷雾干燥...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文涛，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37