SC-β细胞以及用于产生其的组合物和方法技术

本文公开了适用于诱导β细胞成熟的方法、组合物、试剂盒和试剂，以及用于例如细胞疗法等各种应用中的分离的SC‑β细胞群体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2013年6月11日提交的美国临时申请No.61/833,898和2014年3月28日提交的美国临时申请No.61/972,212的权益，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文中。专利技术背景迄今为止，研究仅仅产生了功能异常的表达胰岛素的细胞，其不对连续变化的葡萄糖水平反应来分泌适当量的胰岛素；或在移植至小鼠主体3个月后产生只能够成熟成表达胰岛素的功能细胞的胰腺祖细胞(Cheng等人,2012；D'Amour等人,2005；D'Amour等人,2006；Kroon等人,2008；Nostro等人,2011；Rezania等人,2012；Schulz等人,2012；Xie等人,2013)。与在“葡萄糖刺激的胰岛素分泌”(GSIS)分析中对高水平的葡萄糖反应，释放高水平的胰岛素且可以重复如此进行的正常胰岛或分散的成年β细胞对比，通过现有方法产生的hPSC衍生的表达胰岛素的细胞无法对各种浓度的葡萄糖的添加反应来适当地分泌胰岛素。因此，需要一种从hPSC获得展现正常胰岛的表型的细胞或成熟成体β细胞的方法。专利技术概要在一些方面中，本公开提供一种干细胞衍生β细胞(SC-β)。在一些实施方案中，所述细胞为成熟的。在一些实施方案中，所述细胞展现体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。在一些实施方案中，所述细胞展现体内GSIS反应。在一些实施方案中，所述细胞展现体外及体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。在一些实施方案中，所述细胞展现对至少一次葡萄糖激发的GSIS反应。在一些实施方案中，所述细胞展现对至少两次连续葡萄糖激发的GSIS反应。在一些实施方案中，所述细胞展现对至少三次连续葡萄糖激发的GSIS反应。在一些实施方案中，所述GSIS反应在所述细胞移植至人类或动物后很快观测到。在一些实施方案中，所述GSIS反应在所述细胞移植至人类或动物大约24小时内观测到。在一些实施方案中，所述GSIS反应在所述细胞移植至人类或动物大约2周内观测到。在一些实施方案中，表征为对高葡萄糖浓度起反应所分泌的胰岛素相比于低葡萄糖浓度时的比率的细胞刺激指数类似于内源性成熟胰腺β细胞的刺激指数。在一些实施方案中，所述刺激指数大于或等于1，或大于或等于1.1，或大于或等于1.3，或大于或等于2，或大于或等于2.3，或大于或等于2.6。在一些实施方案中，所述细胞对细胞因子起反应而展现细胞因子诱发的细胞凋亡。在一些实施方案中，所述细胞因子选自由以下组成的组：白细胞介素-1β(IL-β)、干扰素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和其组合。在一些实施方案中，对抗糖尿病剂起反应，胰岛素从所述细胞的分泌得到增强。在一些实施方案中，所述抗糖尿病剂包含选自由以下组成的组的促分泌素：胰岛素模拟物、磺酰脲、氯茴苯酸和其组合。在一些实施方案中，所述细胞为单激素的。在一些实施方案中，所述细胞展现类似于内源性成熟胰腺β细胞的形态的形态。在一些实施方案中，所述细胞展现囊封结晶胰岛素颗粒在电子显微镜下类似于内源性成熟胰腺β细胞的胰岛素颗粒。在一些实施方案中，所述细胞展现低复制速率。在一些实施方案中，所述细胞展现类似于内源性成熟胰腺β细胞的葡萄糖刺激的Ca2+通量(GSCF)的GSCF。在一些实施方案中，所述细胞展现对至少一次葡萄糖激发的GSCF反应。在一些实施方案中，所述细胞展现对至少两次葡萄糖激发的GSCF反应。在一些实施方案中，所述细胞展现对至少三次葡萄糖激发的GSCF反应。在一些实施方案中，所述细胞展现增加的钙通量。在一些实施方案中，所述增加的钙通量包含增加的流入量或低浓度相对于高葡萄糖浓度的流入比率。在一些实施方案中，所述细胞表达至少一种选自由以下组成的组的表征内源性成熟胰腺β细胞的标记物：胰岛素、C-肽、PDX1、MAFA、NKX6-1、PAX6、NEUROD1、葡萄糖激酶(GCK)、SLC2A1、PCSK1、KCNJ11、ABCC8、SLC30A8、SNAP25、RAB3A、GAD2、PTPRN、NKX2-2、Pax4。在一些实施方案中，所述细胞不表达至少一种选自由以下组成的组的标记物：a)由以下组成的组的激素：i)胰高血糖素(GCG)，和ii)生长激素抑制素(SST)；或b)选自由以下组成的腺泡细胞标记物：i)淀粉酶，和ii)羧肽酶A(CPA1)；c)选自由以下组成的α细胞标记物：i)GCG，ii)Arx，iii)Irx1，和Irx2；和d)选自由以下组成的组的导管细胞标记物：i)CFTR，和ii)Sox9。在一些实施方案中，所述细胞从胰岛素阳性内分泌细胞或选自由以下组成的组的其前驱细胞体外分化：Nkx6-1阳性胰腺祖细胞、Pdx1阳性胰腺祖细胞和多潜能干细胞。在一些实施方案中，所述多潜能干细胞选自由以下组成的组：胚胎干细胞及诱导性多潜能干细胞。在一些实施方案中，所述细胞为人类。在一些实施方案中，所述细胞未进行基因修饰。在一些实施方案中，所述细胞进行基因修饰。在一些实施方案中，在高葡萄糖浓度下每1000个细胞每孵育30分钟，每个细胞产生的胰岛素为0.5与10μIU之间。在一些实施方案中，在高葡萄糖浓度下每1000个细胞每孵育30分钟，每个细胞产生的胰岛素为大约2.5μIU。在一些实施方案中，所述孵育离体进行。在一些方面中，本公开提供一种包含SC-β细胞的细胞系。在一些实施方案中，所述细胞系稳定表达胰岛素。在一些实施方案中，所述细胞可冷冻，解冻，且扩增约24小时与44小时之间的倍增时间，无显著形态改变，直至至少30次继代。在一些方面中，本公开提供一种从胰岛素阳性内分泌细胞产生SC-β细胞的方法，所述方法包括使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体与包含以下的至少两种β细胞成熟因子在促进细胞簇集的条件下接触：a)转化生长因子β(TGF-β)信号传导通路抑制剂和b)甲状腺激素信号传导通路活化剂，以诱导所述群体中的至少一种胰岛素阳性内分泌细胞体外成熟成SC-β细胞。在一些实施方案中，所述SC-β细胞展现对至少一次葡萄糖激发的反应。在一些实施方案中，所述SC-β细胞展现对至少两次连续葡萄糖激发的反应。在一些实施方案中，所述SC-β细胞展现对至少三次连续葡萄糖激发的反应。在一些实施方案中，所述SC-β细胞的形态类似于内源性成熟β细胞的形态。在一些实施方案中，所述SC-β细胞展现体外和/或体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。在一些实施方案中，所述GSIS反应在所述SC-β细胞移植至受试者后立即观测到。在一些实施方案中，所述GSIS反应在所述SC-β细胞移植至受试者后大约24小时内观测到。在一些实施方案中，所述GSIS反应在所述SC-β细胞移植至受试者大约两周内观测到。在一些实施方案中，使所述细胞群体与100nM-100μM的浓度的所述TGF-β信号传导通路抑制剂接触。在一些实施方案中，使所述细胞群体与10μM的浓度的所述TGF-β信号传导通路抑制剂接触。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导通路包含TGF-β受体I型激酶信号传导。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导通路抑制剂包含Alk5抑制剂II。在一些实施方案中，所述TGF-β信号传导通路抑制剂包含Alk5抑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干细胞衍生β细胞(SC‑β)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.11 US 61/833,898;2014.03.28 US 61/972,2121.一种干细胞衍生β细胞(SC-β)。2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞为成熟的。3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞展现体外葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现体内GSIS反应。5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现体外和体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现对至少一次葡萄糖激发的GSIS反应。7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现对至少两次连续葡萄糖激发的GSIS反应。8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现对至少三次连续葡萄糖激发的GSIS反应。9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞，其中所述GSIS反应在所述细胞移植至人类或动物后很快观测到。10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞，其中所述GSIS反应在所述细胞移植至人类或动物大约24小时内观测到。11.根据权利要求1至10中任一项所述的细胞，其中所述GSIS反应在所述细胞移植至人类或动物大约2周内观测到。12.根据权利要求1至11中任一项所述的细胞，其中表征为对高葡萄糖浓度起反应所分泌的胰岛素相比于低葡萄糖浓度时的比率的所述细胞的刺激指数类似于内源性成熟胰腺β细胞的刺激指数。13.根据权利要求1至12中任一项所述的细胞，其中所述刺激指数大于或等于1，或大于或等于1.1，或大于或等于1.3，或大于或等于2，或大于或等于2.3，或大于或等于2.6。14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞，其中所述细胞对细胞因子起反应而展现细胞因子诱发的细胞凋亡。15.根据权利要求1至14中任一项所述的细胞，其中所述细胞因子选自由以下组成的组：白细胞介素-1β(IL-β)、干扰素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和其组合。16.根据权利要求1至15中任一项所述的细胞，其中对抗糖尿病剂起反应，胰岛素从所述细胞的分泌得到增强。17.根据权利要求16所述的细胞，其中所述抗糖尿病剂包含选自由以下组成的组的促分泌素：胰岛素模拟物、磺酰脲、氯茴苯酸和其组合。18.根据权利要求1至17中任一项所述的细胞，其中所述细胞为单激素的。19.根据权利要求1至18中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现类似于内源性成熟胰腺β细胞的形态的形态。20.根据权利要求1至19中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现在电子显微镜下类似于内源性成熟胰腺β细胞的胰岛素颗粒的囊封结晶胰岛素颗粒。21.根据权利要求1至20中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现低复制速率。22.根据权利要求1至21中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现类似于内源性成熟胰腺β细胞的葡萄糖刺激的Ca2+通量(GSCF)的GSCF。23.根据权利要求1至22中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现对至少一次葡萄糖激发的GSCF反应。24.根据权利要求1至23中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现对至少两次葡萄糖激发的GSCF反应。25.根据权利要求1至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现对至少三次葡萄糖激发的GSCF反应。26.根据权利要求1至25中任一项所述的细胞，其中所述细胞展现增加的钙通量。27.如权利要求26所述的方法，其中所述增加的钙通量包含增加的流入量或低葡萄糖浓度相对于高葡萄糖浓度的流入比率。28.根据权利要求1至27中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达至少一种选自由以下组成的组的表征内源性成熟胰腺β细胞的标记物：胰岛素、C-肽、PDX1、MAFA、NKX6-1、PAX6、NEUROD1、葡
\t萄糖激酶(GCK)、SLC2A1、PCSK1、KCNJ11、ABCC8、SLC30A8、SNAP25、RAB3A、GAD2、PTPRN、NKX2-2、Pax4。29.根据权利要求1至28中任一项所述的细胞，其中所述细胞不表达至少一种选自由以下组成的组的标记物：a)选自由以下组成的组的激素：i)胰高血糖素(GCG)，和ii)生长激素抑制素(SST)；或b)选自由以下组成的腺泡细胞标记物：i)淀粉酶，和ii)羧肽酶A(CPA1)；c)选自由以下组成的α细胞标记物：i)GCG，ii)Arx，iii)Irx1，和IR；以及d)选自由以下组成的组的导管细胞标记物：i)CFTR，和ii)Sox9。30.根据权利要求1至29中任一项所述的细胞，其中所述细胞从胰岛素阳性内分泌细胞或选自由以下组成的组的其前驱细胞体外分化：Nkx6-1阳性胰腺祖细胞、Pdx1阳性胰腺祖细胞和多潜能干细胞。31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述多潜能干细胞选自由以下组成的组：胚胎干细胞及诱导性多潜能干细胞。32.根据权利要求1至31中任一项所述的细胞，其中所述细胞为人类的。33.根据权利要求1至32中任一项所述的细胞，其中所述细胞未进行基因修饰。34.根据权利要求1至33中任一项所述的细胞，其中所述细胞进行基因修饰。35.根据权利要求1至34中任一项所述的细胞，其中每个细胞产生的胰岛素为在高葡萄糖浓度下每1000个细胞每孵育30分钟在0.5与10μIU之间。36.根据权利要求1至35中任一项所述的细胞，其中每个细胞产生的胰岛素为在高葡萄糖浓度下每1000个细胞每孵育30分钟大约2.5μIU。37.根据权利要求35或36所述的细胞，其中所述孵育离体进行。38.一种细胞系，其包含根据权利要求1至37中任一项所述的细胞。39.根据权利要求38所述的细胞系，其中所述细胞系稳定表达胰岛素。40.根据权利要求38或39所述的细胞系，其中所述细胞可以冷冻，解冻，并扩增约24小时与44小时之间的倍增时间，无显著形态改变，直至至少30次继代。41.一种从胰岛素阳性内分泌细胞产生SC-β细胞的方法，所述方法包括使包含胰岛素阳性内分泌细胞的细胞群体与至少两种包含以下的β细胞成熟因子在促进细胞簇集的条件下接触：a)转化生长因子β(TGF-β)信号传导通路抑制剂和b)甲状腺激素信号传导通路活化剂，以
\t诱导所述群体中的至少一种胰岛素阳性内分泌细胞体外成熟成SC-β细胞。42.如权利要求41所述的方法，其中所述SC-β细胞展现对至少一次葡萄糖激发的反应。43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述SC-β细胞展现对至少两次连续葡萄糖激发的反应。44.如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞展现对至少三次连续葡萄糖激发的反应。45.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞的形态类似于内源性成熟β细胞的形态。46.如权利要求41至45中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞展现体外和/或体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。47.如权利要求41至46中任一项所述的方法，其中所述GSIS反应在所述SC-β细胞移植至受试者后立即观测到。48.如权利要求41至47中任一项所述的方法，其中所述GSIS反应在所述SC-β细胞移植至受试者后大约24小时内观测到。49.如权利要求41至48中任一项所述的方法，其中所述GSIS反应在所述SC-β细胞移植至受试者大约两周内观测到。50.如权利要求41至49中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与100nM-100μM的浓度的所述TGF-β信号传导通路抑制剂接触。51.如权利要求41至50中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与10μM的浓度的所述TGF-β信号传导通路抑制剂接触。52.如权利要求41至51中任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号传导通路包含TGF-β受体I型激酶信号传导。53.如权利要求41至52中任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号传导通路抑制剂包含Alk5抑制剂II。54.如权利要求41至53中任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号传导通路抑制剂包含Alk5抑制剂II的类似物或衍生物。55.如权利要求41至54中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与0.1μM-10μM之间的浓度的所述甲状腺激素信号传导通路活化剂接触。56.如权利要求41至55中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与1μM的浓度的所述甲状腺激素信号传导通路活化剂接触。57.如权利要求41至56中任一项所述的方法，其中所述甲状腺激素信号传导通路活化剂包含三碘甲状腺原氨酸(T3)。58.如权利要求41至57中任一项所述的方法，其中所述细胞群体任选地与蛋白激酶抑制剂接触。59.如权利要求58所述的方法，其中所述细胞群体不与所述蛋白激酶抑制剂接触。60.如权利要求58所述的方法，其中所述细胞群体与所述蛋白激酶抑制剂接触。61.如权利要求60所述的方法，其中使所述细胞群体与10nM-1μM之间的浓度的所述蛋白激酶抑制剂接触。62.如权利要求60或61所述的方法，其中使所述细胞群体与100nM的浓度的所述蛋白激酶抑制剂接触。63.如权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述蛋白激酶抑制剂包含十字孢碱。64.如权利要求41至63中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞群体与至少一种其它β细胞成熟因子接触。65.如权利要求64所述的方法，其中所述至少一种其它β细胞成熟因子包含囊肿性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)抑制剂。66.如权利要求64或65所述的方法，其中使所述细胞群体与100nM-100μM之间的浓度的所述CFTR抑制剂接触。67.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与10nm-10μM的浓度的所述CFTR抑制剂接触。68.如权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述CFTR抑制剂包含Gly-H101。69.如权利要求64至68中任一项所述的方法，其中所述至少一种其它β细胞成熟因子包含O-GlcNAc酶抑制剂。70.如权利要求69所述的方法，其中使所述细胞群体与100nM-100μM之间的浓度的所述O-GlcNAc酶抑制剂接触。71.如权利要求69或70所述的方法，其中使所述细胞群体与10nM-10μM之间的浓度的所述O-GlcNAc酶抑制剂接触。72.如权利要求41至71中任一项所述的方法，其中所述O-GlcNAc酶抑制剂包含ThiametG。73.如权利要求41至72中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在适合培养基中培养。74.如权利要求73所述的方法，其中所述适合培养基包含ConnoughtMedicalResearchLaboratories1066补充胰岛培养基(CMRLS)或CMRLS的组分。75.如权利要求74所述的方法，其中所述CMRLS补充有血清。76.如权利要求74或75所述的方法，其中所述CMRLS补充有10％胎牛血清。77.如权利要求41至76中任一项所述的方法，其中所述促进细胞簇集的条件包含悬浮培养物。78.如权利要求41至77中任一项所述的方法，其中所述细胞群体维持在悬浮培养物中达足以诱导所述细胞群体中至少一种所述胰岛素阳性内分泌细胞体外成熟成至少一种SC-β细胞的时间段。79.如权利要求78所述的方法，其中所述时间段包含至少7天。80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述时间段包含7天与21天之间。81.如权利要求78至60中任一项所述的方法，其中所述时间段包含7天与14天之间。82.如权利要求78至81中任一项所述的方法，其中所述时间段包含10天与14天之间。83.如权利要求78至82中任一项所述的方法，其中所述时间段包含14天。84.如权利要求79至83中任一项所述的方法，其中每隔一天补充所述β细胞成熟因子。85.如权利要求41至84中任一项所述的方法，其中所述细胞群体中至少1％所述胰岛素阳性内分泌细胞被诱导成熟成SC-β细胞。86.如权利要求41至85中任一项所述的方法，其中所述群体中至少99％所述胰岛素阳性内分泌细胞被诱导成熟成SC-β细胞。87.如权利要求41至86中任一项所述的方法，其中所述群体中至少30％所产生的细胞包含SC-β细胞。88.如权利要求41至87中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞表达C-肽、胰岛素、NKX6-1、Pdx1，并共表达NKX6-1和C-肽。89.如权利要求41至88中任一项所述的方法，其中所述胰岛素阳性内分泌细胞还表达Pdx1和NKX6-1。90.如权利要求41至89中任一项所述的方法，其中所述胰岛素阳性内分泌细胞是由选自由胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞组成的
\t组的多潜能干细胞群体产生。91.如权利要求41至90中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞包含人类细胞。92.如权利要求41至91中任一项所述的方法，其中SC-β细胞在体外的产生是可量的。93.一种分离的SC-β细胞群体，其根据如权利要求41至92中任一项所述的方法产生。94.一种微胶囊，其包含囊封在其中的根据权利要求93所述的分离的SC-β细胞群体。95.一种组合物，其包含根据如权利要求41至92中任一项所述的方法产生的SC-β细胞群体。96.一种分析，其包含根据如权利要求41至92中任一项所述的方法产生的分离的SC-β细胞群体。97.如权利要求96所述的分析，其用于鉴别一种或多种促进或抑制选自由以下组成的组的β细胞命运的候选试剂：β细胞增殖、β细胞复制、β细胞死亡、β细胞功能、β细胞对免疫攻击的敏感性或β细胞对去分化或分化的敏感性。98.如权利要求96所述的分析，其用于鉴别一种或多种促进至少一种胰岛素阳性内分泌细胞或其前驱细胞分化成至少一种SC-β细胞的候选试剂。99.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施
\t用包含分离的SC-β细胞群体的组合物，所述SC-β细胞根据如权利要求41至92中任一项所述的方法产生。100.如权利要求99所述的方法，其中所述SC-β细胞被囊封于微胶囊中。101.如权利要求99或100所述的方法，其中所述SC-β细胞由从所述SC-β细胞所施用的同一受试者获得的多潜能干细胞群体产生。102.如权利要求99至101中任一项所述的方法，其中所述SC-β细胞由iPS细胞群体产生，其中所述iPS细胞衍生自从所述SC-β细胞所施用的同一受试者获得的细胞。103.如权利要求99至102中任一项所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病或具有增加的出现糖尿病的风险。104.如权利要求103所述的方法，其中所述糖尿病选自由以下各糖尿病组成的组：I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病和前驱糖尿病。105.如权利要求99至102中任一项所述的方法，其中所述受试者患有代谢病症或具有增加的出现代谢病症的风险。106.一种通过根据权利要求41至102中任一项所述的方法产生的分离的SC-β细胞群体用于施用于需要的受试者的用途。107.如权利要求106所述的用途，其中所述分离的SC-β细胞群体囊封于微胶囊中施用于所述受试者。108.如权利要求106或107所述的用途，其中所述受试者患有糖
\t尿病或具有增加的出现糖尿病的风险。109.如权利要求106至108中任一项所述的用途，其中所述糖尿病选自由以下各糖尿病组成的组：I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病和前驱糖尿病。110.如权利要求106或107所述的用途，其中所述受试者患有代谢病症或具有增加的出现代谢病症的风险。111.一种培养基，其包含a)Alk5抑制剂，b)三碘甲状腺原氨酸(T3)，任选地c)十字孢碱，和任选地d)CMRLS。112.一种如权利要求111所述的培养基用于诱导胰岛素阳性内分泌细胞体外成熟成SC-β细胞的用途，其中所述SC-β细胞展现体外和/或体内GSIS反应。113.一种从Pdx1阳性胰腺祖细胞产生NKX6-1阳性胰腺祖细胞的方法，其包括使包含Pdx1阳性胰腺祖细胞的细胞群体在促进细胞簇集的条件下与包含以下的至少两种β细胞成熟因子接触：a)至少一种来自成纤维细胞生长因子(FGF)家族的生长因子，b)索尼克刺猬通路抑制剂，和任选地c)低浓度的视黄酸(RA)信号传导通路活化剂，历时至少五天时间，从而诱导所述群体中的至少一种Pdx1阳性胰腺祖细胞分化成NKX6-1阳性胰腺祖细胞，其中所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞表达NKX6-1。114.如权利要求113所述的方法，其中使所述细胞群体与1ng/mL-100ng/mL之间的浓度的所述至少一种来自FGF家族的生长因子接触。115.如权利要求113或114所述的方法，其中使所述细胞群体与
\t50ng/mL的浓度的所述至少一种来自FGF家族的生长因子接触。116.如权利要求113至115中任一项所述的方法，其中所述至少一种来自FGF家族的生长因子包含角化细胞生长因子(KGF)。117.如权利要求113至116中任一项所述的方法，其中所述至少一种来自FGF家族的生长因子选自由以下组成的组：FGF2、FGF8B、FGF10和FGF21。118.如权利要求113至117中任一项所述的方法，其中所述细胞群体不与所述RA信号传导通路活化剂接触。119.如权利要求113至117中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与0.01μM-1.0μM之间的浓度的所述RA信号传导通路活化剂接触。120.如权利要求113至117中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与0.1μM的浓度的所述RA信号传导通路活化剂接触。121.如权利要求113至120中任一项所述的方法，其中所述RA信号传导通路活化剂包含RA。122.如权利要求113至121中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与0.1μM与0.5μM之间的浓度的所述SHH通路抑制剂接触。123.如权利要求113至122中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与0.25μM的浓度的所述SHH通路抑制剂接触。124.如权利要求113至123中任一项所述的方法，其中所述SHH通路抑制剂包含Sant1。125.如权利要求113至124中任一项所述的方法，其进一步包括将所述细胞群体暴露于至少一种其它β细胞成熟因子。126.如权利要求125所述的方法，其中所述至少一种其它β细胞成熟因子包含至少一种来自EGF家族的生长因子。127.如权利要求126所述的方法，其中将所述细胞群体暴露于2ng/mL-200ng/mL之间的浓度的所述至少一种来自EGF家族的生长因子。128.如权利要求126或127所述的方法，其中将所述细胞群体暴露于20ng/mL的浓度的所述至少一种来自EGF家族的生长因子。129.如权利要求126至128中任一项所述的方法，其中至少一种来自EGF家族的生长因子选自由以下组成的组：β细胞素和EGF。130.如权利要求113至129中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在适合培养基中培养。131.如权利要求113至130中任一项所述的方法，其中所述促进细胞簇集的条件包含悬浮培养物。132.如权利要求113至131中任一项所述的方法，其中每隔一天补充所述β细胞成熟因子。133.如权利要求113至132中任一项所述的方法，其中蛋白激酶C活化剂在所述5天期间未加入所述悬浮培养物中。134.如权利要求113至132中任一项所述的方法，其中蛋白激酶
\tC活化剂在所述5天前从所述悬浮培养物去除。135.如权利要求113或134所述的方法，其中所述蛋白激酶C活化剂包含PdbU。136.如权利要求113至135中任一项所述的方法，其中BMP信号传导通路抑制剂在所述5天期间未加入所述悬浮培养物中。137.如权利要求113至135中任一项所述的方法，其中BMP信号传导通路抑制剂在所述5天前从所述悬浮培养物去除。138.如权利要求136或137所述的方法，其中所述BMP信号传导通路抑制剂包含LDN193189。139.如权利要求113至138中任一项所述的方法，其中所述群体中至少10％的所述Pdx1阳性胰腺祖细胞被诱导分化成NKX6-1阳性胰腺祖细胞。140.如权利要求113至139中任一项所述的方法，其中所述群体中至少95％的所述Pdx1阳性胰腺祖细胞被诱导分化成NKX6-1阳性胰腺祖细胞。141.如权利要求113至140中任一项所述的方法，其中所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞表达Pdx1、NKX6-1和FoxA2。142.如权利要求113至141中任一项所述的方法，其中所述Pdx1阳性胰腺祖细胞由选自由胚胎干细胞及诱导性多潜能干细胞组成的组的多潜能干细胞群体产生。143.一种分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体，其通过如权利要
\t求113至142中任一项所述的方法获得。144.一种微胶囊，其包含囊封在其中的根据权利要求143所述的分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体。145.一种组合物，其包含根据如权利要求113至142中任一项所述的方法产生的分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体。146.一种分析，其包含根据如权利要求113至142中任一项所述的方法产生的分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体。147.如权利要求146所述的分析，其用于鉴别一种或多种促进至少一种Pdx1阳性胰腺祖细胞或其前驱细胞分化成NKX6-1阳性胰腺祖细胞的候选试剂。148.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含根据如权利要求113至142中任一项所述的方法产生的分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体的组合物。149.如权利要求148所述的方法，其中所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞由从所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞所施用的同一受试者获得的多潜能干细胞群体产生。150.如权利要求148或149所述的方法，其中所述NKX6-1阳性胰腺祖细胞被囊封于微胶囊中。151.如权利要求148至150中任一项所述的方法，其中所述受试者患有糖尿病或具有增加的出现糖尿病的风险。152.如权利要求151所述的方法，其中所述糖尿病选自由以下各
\t糖尿病组成的组：I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病和前驱糖尿病。153.如权利要求148至150中任一项所述的方法，其中所述受试者患有代谢病症或具有增加的出现代谢病症的风险。154.一种通过根据权利要求113至142中任一项所述的方法产生的分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体用于分化成SC-β细胞的用途。155.一种通过根据权利要求113至142中任一项所述的方法产生的分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体用于施用于需要的受试者的用途。156.如权利要求155所述的用途，其中所述分离的NKX6-1阳性胰腺祖细胞群体囊封于微胶囊中施用于所述受试者。157.如权利要求155或156所述的用途，其中所述受试者患有糖尿病或具有增加的出现糖尿病的风险。158.如权利要求157所述的用途，其中所述糖尿病选自由以下各糖尿病组成的组：I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病和前驱糖尿病。159.如权利要求155或156所述的用途，其中所述受试者患有代谢病症或具有增加的出现代谢病症的风险。160.一种培养基，其包含a)KGF，b)SANT1)，和任选地c)RA，其中所述培养基基本上不含PdbU和LDN193189。161.一种如权利要求160所述的培养基用于诱导Pdx1阳性胰腺
\t祖细胞体外分化成NKX6-1阳性胰腺祖细胞的用途。162.一种由NKX6-1阳性胰腺祖细胞产生胰岛素阳性内分泌细胞的方法，其包括使包含NKX6-1阳性胰腺祖细胞的细胞群体在促进细胞簇集的条件下与包含以下的至少两种β细胞成熟因子接触：a)TGF-β信号传导通路抑制剂，和b)甲状腺激素信号传导通路活化剂，以诱导所述群体中的至少一种NKX6-1阳性胰腺祖细胞分化成至少一种胰岛素阳性内分泌细胞，其中所述胰岛素阳性胰腺祖细胞表达胰岛素。163.如权利要求162所述的方法，其中使所述细胞群体与1μM-100μM之间的浓度的所述TGF-β信号传导通路抑制剂接触。164.如权利要求162或163所述的方法，其中使所述细胞群体与10μM的浓度的所述TGF-β信号传导通路抑制剂接触。165.如权利要求162至164中任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号传导通路包含TGF-β受体I型激酶信号传导。166.如权利要求162至165中任一项所述的方法，其中所述TGF-β信号传导通路抑制剂包含Alk5抑制剂II。167.如权利要求162至166中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与0.1μM-10μM之间的浓度的所述甲状腺激素信号传导通路活化剂接触。168.如权利要求162至167中任一项所述的方法，其中使所述细胞群体与1μM的浓度的所述甲状腺激素信号传导通路活化剂接触。169.如权利要求162至168中任一项所述的方法，其中所述甲状腺激素信号传导通路活化剂包含三碘甲状腺原氨酸(T3)。170.如权利要求162至169中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞群体与至少一种其它β细胞成熟因子接触。171.如权利要求170所述的方法，其中所述至少一种其它β细胞成熟因子包含γ-分泌酶抑制剂。172.如权利要求171所述的方法，其中使所述细胞群体与0.1μM-10μM之间的浓度的所述γ-分泌酶抑制剂接触。173.如权利要求171或172所述的方法，其中使所述细胞群体与1μM的浓度的所述γ-分泌酶抑制剂接触。174.如权利要求171至173中任一项所述的方法，其中所述γ-分泌酶抑制剂包含XXI。175.如权利要求171至174中任一项所述的方法，其中所述γ-分泌酶抑制剂包含DAPT。176.如权利要求170至175中任一项所述的方法，其中所述至少一种其它β细胞成熟因子包含至少一种来自EGF家族的生长因子。177.如权利要求176所述的方法，其中使所述细胞群体与2ng/mL-200ng/mL之间的浓度的所述至少一种来自EGF家族的生长因子接触。178.如权利要求176或177所述的方法，其中使所述细胞群体与20ng/mL的浓度的至少一种来自EGF家族的生长因子接触。179.如权利要求176至178中任一项所述的方法，其中所述至少
\t一种来自EGF家族的生长因子包含β细胞素。180.如权利要求176至178中任一项所述的方法，其中所述至少一种来自EGF家族的生长因子包含EGF。181.如权利要求170至180中任一项所述的方法，其中所述至少一种其它β细胞成熟因子包含低浓度的视黄酸(RA)信号传导通路活化剂。182.如权利要求181所述的方法，其中使所述细胞群体与0.01μM-1.0μM之间的浓度的所述RA信号传导通路活化剂接触。183.如权利要求181或182所述的方法，其中使所述细胞群体与0.1μM的浓度的所述RA信号传导通路活化剂接触。184.如权利要求181至183中任一项所述的方法，其中所述RA信号传导通路活化剂包含RA。185.如权利要求170至184中任一项所述的方法，其中所述至少一种其它β细胞成熟因子包含索尼克刺猬(SHH)通路抑制剂。186.如权利要求185所述的方法，其中使所述细胞群体与0.1μM与0.5μM之间的浓度的所述SHH通路抑制剂接触。187.如权利要求185或186所述的方法，其中使所述细胞群体与0.25μM的浓度的所述SHH通路抑制剂接触。188.如权利要求185至187中任一项所述的方法，其中所述SHH通路抑制剂包含Sant1。189.如权利要求162至188中任一项所述的方法，其中所述细胞群体任选地与蛋白激酶抑制剂接触。190.如权利要求189所述的方法，其中所述细胞群体不与所述蛋白激酶抑制剂接触。191.如权利要求189所述的方法，其中使所述细胞群体与所述蛋白激酶抑制剂接触。192.如权利要求191所述的方法，其中使所述细胞群体与10nM-1μM之间的浓度的所述蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：奎因·P·彼得森，费利西娅·J·帕柳卡，道格拉斯·A·梅尔顿，杰弗里·R·米尔曼，迈克尔·萨里斯·西格尔，马德斯·居特勒，阿里礼萨·蕾扎尼亚，本杰明·弗赖尔，
申请(专利权)人：哈佛学院校长同事会，杨森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US