一种多靶标特异性核酸适体的富集方法，包括如下步骤：（1）将待富集核酸文库与非靶细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸分子，得到与所述非靶细胞不结合的核酸分子；（2）为如下a）或b）：a）依次进行如下a1）和a2）：a1）将步骤（1）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与靶细胞1共同孵育形成孵育体系1，吸出所述孵育体系1中不含所述靶细胞1的液体，将其命名为孵育液1，所述孵育液1中含有与所述靶细胞1不结合的核酸分子；将所述孵育液1与靶细胞2共同孵育，形成孵育体系2，吸出所述孵育体系2中不含所述靶细胞2的液体，将其命名为孵育液2，所述孵育液2中含有与所述靶细胞2不结合的核酸分子；a2）洗涤步骤a1）中孵育后的2种靶细胞，对洗涤后的与所述2种靶细胞结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物，使与所述2种靶细胞中的至少一种特异结合的核酸分子得到富集；b）依次进行如下b1）和b2）：b1）将步骤（1）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与靶细胞1共同孵育形成孵育体系1，吸出所述孵育体系1中不含所述靶细胞1的液体，将其命名为孵育液1，所述孵育液1中含有与所述靶细胞1不结合的核酸分子；将所述孵育液1与靶细胞2共同孵育形成孵育体系2，吸出所述孵育体系2中不含所述靶细胞2的液体，将其命名为孵育液2，所述孵育液2中含有与所述靶细胞2不结合的核酸分子；依此类推，直至将孵育液N?1与靶细胞N共同孵育形成孵育体系N，吸出所述孵育体系N中不含所述靶细胞N的液体，将其命名为孵育液N，所述孵育液N中含有与所述靶细胞N不结合的核酸分子；b2）洗涤步骤b1）中孵育后的N种靶细胞，对洗涤后的与所述N种靶细胞结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物，使与所述N种靶细胞中的至少一种特异结合的核酸分子得到富集；所述N为3以上的自然数；（3）以步骤（2）a2）中得到的扩增产物或步骤（2）b2）中得到的扩增产物作为待富集核酸文库，将所述待富集核酸文库与所述非靶细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸分子，得到与所述非靶细胞不结合的核酸分子；（4）为如下c）或d）：c）将步骤（3）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与所述靶细胞1共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞1，对洗涤后的与所述靶细胞1所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物1，使与所述靶细胞1特异结合的核酸分子得到富集；将所述扩增产物1与所述靶细胞2共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞2，对洗涤后的与所述靶细胞2所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物2，使与所述靶细胞1和所述靶细胞2均特异结合的核酸分子得到富集；d）将步骤（3）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与所述靶细胞1共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞1，对洗涤后的与所述靶细胞1所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物1，使与所述靶细胞1特异结合的核酸分子得到富集；将所述扩增产物1与所述靶细胞2共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞2，对洗涤后的与所述靶细胞2所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物2，使与所述靶细胞1和所述靶细胞2均特异结合的核酸分子得到富集；依此类推，直至将扩增产物N?1与所述靶细胞N共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞N，对洗涤后的与所述靶细胞N所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物N，使与所述N种靶细胞均特异结合的核酸分子得到富集；所述N为3以上的自然数。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了。包括如下步骤：1）将待富集核酸文库与非靶细胞孵育，得到与非靶细胞不结合的核酸分子1；2）将核酸分子1依次与N种靶细胞孵育，收集与各靶细胞结合的核酸分子作为下轮待富集文库，重复步骤1）、2），使与N种靶细胞中至少一种特异结合的核酸分子富集；3）将步骤2）富集产物与非靶细胞孵育，得到与非靶细胞不结合的核酸分子2；4）将核酸分子2与N种靶细胞循环孵育，以与前一靶细胞结合的核酸分子作为与下一靶细胞孵育的核酸文库，依次与所有靶细胞孵育，重复步骤3）、4），使与N种靶细胞均特异结合的核酸分子富集。该方法富集的核酸适体高亲和多种靶细胞，在肿瘤诊断中应用前景很大。【专利说明】
本专利技术涉及。
技术介绍
核酸适配体(Aptamer，也称核酸识体、核酸适体、适配子)是长度为20-100个核苷酸，能特异性结合靶标的单链寡核苷酸(DNA或RNA)。核酸适体的作用原理和抗体类似，可在适合的环境下通过折叠形成独特的二维结构或具有茎环、凸出、发夹等复杂三维结构，进而识别各种不同的分子(氨基酸、多肽、金属离子、蛋白质、核酸、病毒及细胞等)。核酸适体相比抗体又有很多独特的优势，例如合成简单、免疫原性低、体外容易修饰和价格低廉等。此外，核酸适体特异性和亲和力强， 可连接其它功能基团和分子，比抗体的分子小，方便进行体内影像诊断和治疗，可反复使用、方便保存和运输。这些优势使得核酸适体的研究应用更为广泛，尤其对于肿瘤细胞等免疫原性弱或分子结构未知的靶标检测具有巨大的优势。利用核酸适体制作细胞表面分子变化图谱，可进行疾病的分子病理分型，以辅助病理学诊断。此外，核酸适体可通过亲和层析方法纯化其配体，特异提取其识别的细胞膜表面抗原，从而发现新的肿瘤标志物蛋白，为靶向治疗药物的开发提供靶标。能够结合某种靶标的特异性核酸适体是通过指数富集配体系统进化(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术筛选而来的。利用SELEX筛选过程，通过重复的适体与靶标的吸附分配、结合适体洗脱回收及聚合酶链扩增(PCR)三个基本步骤，经过多轮筛选可从人工合成的包含IO13-1O16个随机寡核苷酸的DNA/RNA文库中筛选出与生物靶标特异结合且亲和力高的核酸适配体序列。最初的核酸适体筛选主要以蛋白、金属离子及有机染料小分子为靶标，谭蔚泓的研究小组优化了筛选过程，设计出以细胞这种复合靶标为基础的核酸适体筛选过程:cell-SELEX，使细胞特异、特别是肿瘤细胞特异的核酸适体筛选得以实现。经筛选出的序列经过PCR扩增电泳分离形成多个小序列克隆，随后进行测序及序列分析，选择具有代表性的适体克隆进行进一步的结合特性分析。为了缩小最小结合区域的核酸适体序列范围，还可以对核酸适体进行突变及截短实验，以优化核酸适配体的结构。最后大多数筛选出的核酸适体都要进行筛选后的修饰，以提高稳定性便于应用于分析检测或靶标纯化。核酸适体是特定的核苷酸序列，具有非常高的亲和力及特异性。在诊断及检测分析中，核酸适体可以替代抗体识别靶标，还可区分同一蛋白分子的不同空间构象及折叠，因而比抗体识别的靶标更精确。核酸适体对于靶标的空间构象极其敏感，即当靶标的分子构象发生变化时，核酸适体对靶标的结合就不复存在。因此，核酸适体的实际应用最多的就是用其寻找疾病相关抗原，通过细胞表面分子的微细差异进一步区分不同分化程度的细胞以及感染及非感染细胞。由于肿瘤发生时，原本存在于正常细胞膜表面的抗原因糖基化等发生了空间构象的改变，因此利用核酸适体可以筛选到肿瘤细胞特异的识别分子，可以作为区分正常与异常细胞的分子标签，从混合细胞群中分离鉴定出肿瘤细胞，有助于肿瘤的早诊。
技术实现思路
本专利技术公开了。本专利技术所提供的多靶标特异性核酸适体的富集方法具体可包括如下步骤:(I)将待富集核酸文库与非靶细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸分子，得到与所述非靶细胞不结合的核酸分子；(2)为如下 a)或 b):a)依次进行如下al)和a2):al)将步骤(1)得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与靶细胞I共同孵育形成孵育体系1，吸出所述孵育体系 I中不含所述靶细胞I的液体，将其命名为孵育液1，所述孵育液I中含有与所述靶细胞I不结合的核酸分子；将所述孵育液I与靶细胞2共同孵育，形成孵育体系2，吸出所述孵育体系2中不含所述靶细胞2的液体，将其命名为孵育液2，所述孵育液2中含有与所述靶细胞2不结合的核酸分子；a2)洗涤步骤al)中孵育后的2种靶细胞，对洗涤后的与所述2种靶细胞结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物，使与所述2种靶细胞中的至少一种特异结合的核酸分子得到富集；b)依次进行如下bl)和b2):bl)将步骤(1)得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与靶细胞I共同孵育形成孵育体系1，吸出所述孵育体系I中不含所述靶细胞I的液体，将其命名为孵育液1，所述孵育液I中含有与所述靶细胞I不结合的核酸分子；将所述孵育液I与靶细胞2共同孵育形成孵育体系2，吸出所述孵育体系2中不含所述靶细胞2的液体，将其命名为孵育液2，所述孵育液2中含有与所述靶细胞2不结合的核酸分子；依此类推，直至将孵育液N-1与靶细胞N共同孵育形成孵育体系N，吸出所述孵育体系N中不含所述靶细胞N的液体，将其命名为孵育液N，所述孵育液N中含有与所述靶细胞N不结合的核酸分子；b2)洗涤步骤bl)中孵育后的N种靶细胞，对洗涤后的与所述N种靶细胞结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物，使与所述N种靶细胞中的至少一种特异结合的核酸分子得到富集；所述N为3以上的自然数；(3)以步骤(2)a2)中得到的扩增产物或步骤(2) b2)中得到的扩增产物作为待富集核酸文库，将所述待富集核酸文库与所述非靶细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸分子，得到与所述非靶细胞不结合的核酸分子；(4)为如下 c)或 d):c)将步骤(3)得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与所述靶细胞I共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞1，对洗涤后的与所述靶细胞I所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物1，使与所述靶细胞I特异结合的核酸分子得到富集；将所述扩增产物I与所述靶细胞2共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞2，对洗涤后的与所述靶细胞2所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物2，使与所述靶细胞I和所述靶细胞2均特异结合的核酸分子得到富集；d)将步骤(3)得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与所述靶细胞I共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞1，对洗涤后的与所述靶细胞I所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物1，使与所述靶细胞I特异结合的核酸分子得到富集；将所述扩增产物I与所述靶细胞2共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞2，对洗涤后的与所述靶细胞2所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物2，使与所述靶细胞I和所述靶细胞2均特异结合的核酸分子得到富集；依此类推，直至将扩增产物N-1与所述靶细胞N共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞N，对洗涤后的与所述靶细胞N所结合的所述待富集本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多靶标特异性核酸适体的富集方法，包括如下步骤：（1）将待富集核酸文库与非靶细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸分子，得到与所述非靶细胞不结合的核酸分子；（2）为如下a）或b）：a）依次进行如下a1）和a2）：a1）将步骤（1）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与靶细胞1共同孵育形成孵育体系1，吸出所述孵育体系1中不含所述靶细胞1的液体，将其命名为孵育液1，所述孵育液1中含有与所述靶细胞1不结合的核酸分子；将所述孵育液1与靶细胞2共同孵育，形成孵育体系2，吸出所述孵育体系2中不含所述靶细胞2的液体，将其命名为孵育液2，所述孵育液2中含有与所述靶细胞2不结合的核酸分子；a2）洗涤步骤a1）中孵育后的2种靶细胞，对洗涤后的与所述2种靶细胞结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物，使与所述2种靶细胞中的至少一种特异结合的核酸分子得到富集；b）依次进行如下b1）和b2）：b1）将步骤（1）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与靶细胞1共同孵育形成孵育体系1，吸出所述孵育体系1中不含所述靶细胞1的液体，将其命名为孵育液1，所述孵育液1中含有与所述靶细胞1不结合的核酸分子；将所述孵育液1与靶细胞2共同孵育形成孵育体系2，吸出所述孵育体系2中不含所述靶细胞2的液体，将其命名为孵育液2，所述孵育液2中含有与所述靶细胞2不结合的核酸分子；依此类推，直至将孵育液N?1与靶细胞N共同孵育形成孵育体系N，吸出所述孵育体系N中不含所述靶细胞N的液体，将其命名为孵育液N，所述孵育液N中含有与所述靶细胞N不结合的核酸分子；b2）洗涤步骤b1）中孵育后的N种靶细胞，对洗涤后的与所述N种靶细胞结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物，使与所述N种靶细胞中的至少一种特异结合的核酸分子得到富集；所述N为3以上的自然数；（3）以步骤（2）a2）中得到的扩增产物或步骤（2）b2）中得到的扩增产物作为待富集核酸文库，将所述待富集核酸文库与所述非靶细胞孵育，分离去除与所述非靶细胞结合的核酸分子，得到与所述非靶细胞不结合的核酸分子；（4）为如下c）或d）：c）将步骤（3）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与所述靶细胞1共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞1，对洗涤后的与所述靶细胞1所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物1，使与所述靶细胞1特异结合的核酸分子得到富集；将所述扩增产物1与所述靶细胞2共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞2，对洗涤后的与所述靶细胞2所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物2，使与所述靶细胞1和所述靶细胞2均特异结合的核酸分子得到富集；d）将步骤（3）得到的与所述非靶细胞不结合的核酸分子与所述靶细胞1共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞1，对洗涤后的与所述靶细胞1所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物1，使与所述靶细胞1特异结合的核酸分子得到富集；将所述扩增产物1与所述靶细胞2共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞2，对洗涤后的与所述靶细胞2所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物2，使与所述靶细胞1和所述靶细胞2均特异结合的核酸分子得到富集；依此类推，直至将扩增产物N?1与所述靶细胞N共同孵育，收集并洗涤孵育后的所述靶细胞N，对洗涤后的与所述靶细胞N所结合的所述待富集核酸文库中的核酸分子进行扩增，获得扩增产物N，使与所述N种靶细胞均特异结合的核酸分子得到富集；所述N为3以上的自然数。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马洁，赵晨，徐丽，袁伟，唐万燕，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：
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