从RNA样本富集转录本的方法及其用途技术

本发明专利技术提出了从RNA样本富集转录本的方法及其用途。从RNA样本富集转录本的方法，包括：利用富集试剂对RNA样本进行处理，以便富集转录本，其中，所述富集试剂具有5’-单磷酸外切酶活性，所述转录本为在其5’末端具有帽子结构或三磷酸基团的RNA分子。利用该方法能够有效地富集转录本。

【技术实现步骤摘要】
从RNA样本富集转录本的方法及其用途
本专利技术涉及生物
，具体的，本专利技术涉及从RNA样本富集转录本的方法及其用途，更具体的，本专利技术涉及从RNA样本富集转录本的方法、构建测序文库的方法、测序文库、核酸样本测序方法、确定转录起点(transcriptionstartsite,TSS)的方法、用于从RNA样本富集转录本的富集试剂、构建测序文库的装置、核酸样本测序设备以及确定TSS的系统。
技术介绍
基因的转录过程是从RNA聚合酶与DNA模板的启动子位置结合开始，然后从转录起点(transcriptionstartsite,在本文中简称为：TSS)进行转录延伸，最终形成完整的RNA。生物体内存在的RNA分子都是从TSS开始的，因此通过高通量测序研究TSS有助于我们从全基因组推测启动子的位置及结构，从而全局了解基因转录调控网络。TSS的研究也有助于修正原有的基因注释或发现新的基因。然而，目前对于TSS的研究，仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种能够有效富集转录本，进而可以有效确定TSS的手段。本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：目前，关于高通量测序研究TSS的方法通常是针对具有帽子结构的RNA，采用CAGE或RACE的方法捕获RNA分子的5’末端。常见的有deepCAGE，PEAT，deep-RACE，nanoCAGE和CAGEscan。其中deepCAGE，PEAT，deep-RACE和CAGEscan需要酶切等繁琐操作，对RNA的要求量很高，而且产生的测序序列（reads）较短（大约20nt），只适用于具有帽子结构的RNA，不能用于没有帽子结构的原核RNA的TSS的研究。尽管nanoCAGE操作比较简单，对RNA的使用量要求也低，但是也只适用于具有帽子结构的RNA，而且产生的数据中假阳性比较多。专利技术人发现通过采用5’单磷酸外切酶，能够特异性地降解5’单磷酸的RNA，保留具有5’帽子和5’三磷酸的完整的RNA分子，可以有效地应用于富集转录本，因而能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种从RNA样本富集转录本的方法。根据本专利技术的实施例，该从RNA样本富集转录本的方法包括：利用富集试剂对RNA样本进行处理，以便富集转录本，其中，所述富集试剂具有5’-单磷酸外切酶活性，所述转录本为在其5’末端具有帽子结构或5’三磷酸的RNA分子。由于5’单磷酸外切酶，能够特异性地降解5’单磷酸的RNA，而不会降解具有5’帽子和5’三磷酸的完整的RNA分子，从而利用具有该5’单磷酸外切酶活性的富集试剂，可以有效地富集转录本，因而能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种构建测序文库的方法。根据本专利技术的实施例，该构建测序文库的方法包括：根据前面所述的方法，从RNA样本富集转录本；去除所述转录本的5’帽子结构或5’三磷酸，以便获得去除5’帽子结构或5’三磷酸的转录本；在去除5’帽子结构或5’三磷酸的转录本的5’末端连接RNA接头，以便获得连接有RNA接头的转录本；对连接有RNA接头的转录本进行反转录，以便获得与所述转录本对应的cDNA；对所述cDNA进行扩增，以便获得扩增产物；以及基于所述扩增产物，构建测序文库。由此，利用该方法，能够有效地针对核酸样本中所富集的转录本构建测序文库，因而能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种测序文库，其特征在于，是由前面所述的方法构建的。利用该测序文库，能够有效的对RNA转录本进行测序，能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种核酸样本测序方法。根据本专利技术的实施例，该核酸样本测序方法包括：根据前面所述的方法，构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果。利用该方法，能够有效的对RNA转录本进行测序，能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种用于确定TSS的方法。根据本专利技术的实施例，该确定TSS的方法包括：从宿主提取RNA样本；利用前面所述的方法，获得由多个测序序列构成的测序结果；以及基于所述测序结果，确定TSS。利用该方法，可以有效地确定转录起始位点，能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第六方面，本专利技术提出了一种用于从RNA样本富集转录本的富集试剂。根据本专利技术的实施例，富集试剂具有5’-单磷酸外切酶活性。利用该富集试剂，可以有效地富集转录本，因而能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第七方面，本专利技术提出了一种构建测序文库的装置。根据本专利技术的实施例，该构建测序文库的装置包括：转录本富集单元，所述转录本富集装置中设置有前面所述的富集试剂，以便从RNA样本富集转录本；末端修整单元，所述末端修整单元与所述转录本富集单元相连，并且适于去除所述转录本的5’帽子结构或5’三磷酸，以便获得去除5’帽子结构或5’三磷酸的转录本；RNA接头连接单元，所述RNA接头连接单元与末端修整单元相连，并且适于在去除5’帽子结构或5’三磷酸的转录本的5’末端连接RNA接头，以便获得连接有RNA接头的转录本；反转录单元，所述反转录单元与所述RNA接头连接单元相连，并且适于对连接有RNA接头的转录本进行反转录，以便获得与所述转录本对应的cDNA；扩增单元，所述扩增单元与所述反转录单元相连，并且适于对所述cDNA进行扩增，以便获得扩增产物；以及文库构建单元，所述文库构建单元与所述扩增单元相连，并且适于基于所述扩增产物，构建测序文库。利用该装置，能够有效地针对核酸样本中所富集的转录本构建测序文库，因而能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第八方面，本专利技术提出了一种核酸样本测序设备，其特征在于，包括：文库构建装置，所述文库构建装置为前面所述的装置，以便针对核酸样本构建测序文库；以及测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，并且适于对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果。利用该装置，能够有效的对RNA转录本进行测序，能够同时应用于真核和原核的RNA的TSS的高通量测序，具有操作简单，准确率高和成本低的众多优点。在本专利技术的第九方面，本专利技术提出了一种确定TSS的系统。根据本专利技术的实施例，该系统包括：样品提取设备，所述样品提取设备用于从宿主提取RNA样本；核酸样本测序设备，所述核酸样本测序设备与所述样品提取设备相连，并且所述测序设备为前面所述的核酸样本测序设备，以便针对所述RNA样本进行测序，从而获得由多个测序序列构成的测序结果；以及TSS确定设备，所述TSS确定装置与本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从RNA样本富集转录本的方法，其特征在于，包括：利用富集试剂对RNA样本进行处理，以便富集转录本，其中，所述富集试剂具有5’‑单磷酸外切酶活性，所述转录本为在其5’末端具有帽子结构或三磷酸基团的RNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种确定转录起点的方法，其特征在于，包括：从宿主提取RNA样本，利用富集试剂对所述RNA样本进行处理，以便富集转录本，其中，所述富集试剂具有5’-单磷酸外切酶活性，所述转录本为在其5’末端具有帽子结构或三磷酸基团的RNA分子；对处理后的RNA样本进行测序文库构建，包括，去除所述转录本的帽子结构或三磷酸基团，以便获得去除帽子结构或三磷酸基团的转录本，在去除帽子结构或三磷酸基团的转录本的5’末端连接RNA接头，以便获得连接有RNA接头的转录本，对连接有RNA接头的转录本进行反转录，以便获得与所述转录本对应的cDNA，所述反转录的反转录引物在其末端具有与所述RNA接头相对应的序列，所述反转录采用序列如SEQIDNO：1所示的寡核苷酸5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3’作为反转录引物，所述反转录引物中至少一个N被硫代修饰，对所述cDNA进行扩增，以便获得扩增产物，基于所述扩增产物，构建测序文库；对所述测序文库进行测序，获得由多个测序序列构成的测序结果；基于所述测序结果，确定转录起点，包括，将所述测序结果与参考序列进行比对，所述参考序列中包含预定基因的5’-UTR序列的至少一部分：针对原核宿主，所述参考序列包含所述预定基因的翻译起始位点与该翻译起始位点上游700bp位点之间的核酸序列，针对真核宿主，所述参考序列包含所述预定基因的翻译起始位点与该翻译起始位点上游5000bp位点之间的核酸序列，基于获得的比对结果，选择能够和所述参考序列对上、且在所述参考序列最上游的测序序列作为阳性序列，对所述阳性序列进行筛选，所述筛选的原则是：所述阳性序列的数目是比对到所述预定基因内部的测序序列数目平均值的N倍以上，其中所述N为至少10的实数，确定获得的筛选结果中的阳性序列的第一位碱基作为所述转录起始位点。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用末端修整试剂去除所述转录本的帽子结构或三磷酸基团，其中，所述末端修整试剂具有烟草酸焦磷酸酶活性。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反转录引物中倒数第二个N被硫代修饰。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序利用IlluminaHiseq2000、GenomeAnalyzer、SOLiD测序系统、IonTorrent、IonProton、454、PacBioRS测序系统、HelicostSMS技术以及纳米孔测序技术的至少一种进行。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA样本为宿主的总RNA的至少一部分。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用SOAPAlignment进行所述比对。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对筛选结果进行卡方检验，所述卡方检验的检验值为3.84以上。8.一种确定转录起点的系统，其特征在于，包括：样品提取设备，所述样品提取装置用于从宿主提取RNA样本；核酸样本测序设备，所述核酸样本测序设备与所述样品提取装置相连，所述核酸样本测序设备包括文库构建装置和测序装置，所述文库构建装置包括，转录本富集单元，所述转录本富集装置中设置有富集试剂，所述富集试剂具有5’-单磷酸外切酶活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝珍珍，黄文潘，章文蔚，陈茂山，张艳艳，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44