通过互补测序识别抗生素靶标的方法技术

披露了一种用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因的方法，该方法包括步骤：（a）通过包括在所述抗生素的存在下对生长进行选择以产生抗生素抗性突变株克隆的步骤的方法产生所述细菌的抗生素抗性突变株（AbR突变株）；（b）用：（i）所述细菌的一个或多个必需基因；以及（ii）插入时使细菌DNA失活的转座子转化AbR突变株，以产生对于所述一个或多个必需基因是局部二倍体的转座子突变株的库；（c）在不同量的所述抗生素的存在下，使来自局部二倍体库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物；以及（d）比较测试培养物之间的转座子插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过互补测序识别抗生素靶标的方法
本专利技术涉及用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因的方法，涉及用于识别抗生素的方法以及涉及用于生产包括所述抗生素的抗生素和药物组合物的方法。
技术介绍
对于抵抗新的病原体的出现和对现有抗微生物药的耐药性的新的抗生素存在迫切需要。识别候选抗生素的靶标是至关重要的，因为这些信息能够为获得大量功能相关的新型药类提供途径。例如，作为青霉素靶标的青霉素结合蛋白的发现导致开发了一大类抗生素，包括数代的头孢菌素类、青霉素类以及碳青霉烯类（参见Schmid(2006)NatureBiotechnology24(4):419-420）。目前已经描述了转座子引导的插入位点测序（TraDIS-参见Langridgeetal.(2009)GenomeResearch19:2308-2316），并且用于识别：（a）必需基因；（b）有利于生长（但非必需）的基因；（c）在特定条件下不利于生长的基因；以及（d）与对某些条件提供耐受性有关的基因（“小环境特异性（niche-specific）”必需基因）。已经在例如Gawronskietal.(2009)PNAS106:16422-16427；Goodmanetal.(2009)CellHostMicrobe6:279-289；vanOpijnenetal.(2009)Nat.Methods6:767-772以及Gallagheretal.(2011)mBio2(1):e00315-10中描述类似的技术，并且这类技术目前共同地被称为“Tn-seq”方法。然而，一类重要的抗生素靶标是与在所使用的生长条件中生存所必需的细胞过程有关的基因产物。这类靶标不能通过Tn-seq（包括TraDIS）识别，因为转座子插入至必需基因（包括作为抗生素靶标的那些）没有明显表现在初始突变株库（initialmutantpool）中。因此，在有或没有（或有不同量的）抗生素的情况下生长突变株库后不会出现转座子分布的差异，以该结果Tn-seq不能区别必需基因和作为抗生素靶标的必需基因。因此需要对于能够识别作为抗生素靶标的必需基因的抗生素靶标的高通量功能筛选。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因方法，该方法包括步骤：（a）通过包括在所述抗生素的存在下对生长进行选择以产生抗生素抗性突变株克隆的步骤的方法来产生所述细菌的抗生素抗性突变株（AbR突变株）；（b）用：（i）所述细菌的一个或多个必需基因；以及（ii）插入时使细菌DNA失活的转座子来转化AbR突变株，以产生对于所述一个或多个必需基因来说是局部二倍体的并且带有转座子介导的失活基因的转座子突变株的库；（c）在不同量的所述抗生素的存在下，使来自局部二倍体库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物；以及（d）比较测试培养物之间的转座子插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。优选地，在步骤（b）中首先用包含所述细菌的一个或多个必需基因的载体DNA转化AbR突变株。进一步地，在步骤（b）中首先用包含所述细菌的一个或多个必需基因的载体DNA然后用转座子转化AbR突变株。在这些实施方式中，可以首先用染色体外元件（extrachromosamalelement）（例如质粒或BAC）转化所述AbR突变株，所述染色体外元件包括：（i）所述细菌的一个或多个必需基因；和（ii）一个或多个转座子重复序列；然后用转座子递送质粒转化（例如通过与供体细菌结合），所述转座子递送质粒包含：（i）编码转座酶的基因；和（ii）反序重复转座酶识别位点；其中染色体外元件的一个或多个转座子重复序列提供对由转座子递送质粒所递送的转座子的转座子免疫性。该方法可以进一步包括步骤：（a）通过用激活转座子（TnA）的转座子诱变产生突变细菌库，其中TnA包括启动子，以使进入细菌DNA的转座子插入增加插入位点处或附近的基因的转录；（b）在不同量的所述抗生素的存在下，使来自突变株库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物；以及（c）比较测试培养物之间TnA插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。在另一个方面，提供用于识别抗生素的方法，该方法包括识别根据本专利技术的方法作为所述抗生素的靶标的必需基因。在进一步的方面，提供用于生产抗生素的方法，通过包括识别根据本专利技术的方法作为所述抗生素的靶标的必需基因的方法来识别抗生素。这种方法可以可选地进一步包括合成所述抗生素的步骤，并且可以可选地进一步包括使合成的抗生素与药用赋形剂混合以生产药物组合物的步骤。在更进一步的方面，提供用于识别在细菌内作为抗生素靶标的基因（例如必需基因）的方法，该方法包括步骤：（a）用染色体外元件（例如质粒或BAC）转化细菌以产生对于所述一个或多个必需基因来说是局部二倍体的细菌的库，该染色体外元件包括：（i）所述细菌的一个或多个必需基因；和（ii）一个或多个转座子重复序列；以及（b）用转座子递送质粒转化步骤（a）的局部二倍体，该转座子递送质粒包括：（i）编码转座酶的基因；和（ii）反序重复的转座酶识别位点；其中步骤（a）的染色体外元件的一个或多个转座子重复序列提供对由步骤（b）的质粒递送的转座子的转座子免疫性。在更进一步的方面，提供在本专利技术的方法中使用的转座子递送质粒，其包括：（i）编码转座酶的基因；和（ii）反序重复的转座酶识别位点。在另一个方面，提供包括转座子递送质粒的试剂盒，该转座子递送质粒包括：（i）编码转座酶的基因；和（ii）反序重复的转座酶识别位点，试剂盒可选地进一步包括质粒或BAC，该质粒或BAC包括：（i）细菌的一个或多个必需基因；和（ii）一个或多个转座子重复序列，其中转座子重复序列提供了对由转座子递送质粒所递送的转座子的转座子免疫性。使用由对于一个或多个必需基因来说是局部二倍体的抗生素抗性突变株产生的转座子突变株库确保必需基因（包括作为抗生素靶标的那些）中的转座子插入出现在初始突变株库中，因为在抗生素靶标基因中的转座子插入在非选择性条件下产生可存活的表现型（当必需基因的野生型拷贝与插入失活的突变拷贝互补时）但是在选择性条件下不产生可存活的表现型（当必需基因的野生型拷贝与插入失活的突变拷贝不互补时）。因此，可以容易地检测在局部二倍体突变株库在存在或不存在抗生素的情况下生长后的转座子分布差异，允许作为抗生素靶标的必需基因的识别。在以下提出的其他权利要求中限定并描述了本专利技术的其他方面和优选的实施方式。具体实施方式本文中提及的所有出版物、专利、专利申请以及其他参考文献通过以其整体引用而用于所有目的将其全部内容合并于此，如同明确地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入并且全文引用其内容。定义与一般优选在本文使用的情况下并且除非明确地另外指出，以下术语旨在除具有在本领域的术语可能享有的任何较宽泛（或较窄）的含义外还具有以下含义：除非通过上下文另外要求，在本文中使用的单数应被理解为包括复数形式，并且反之亦然。与实体有关的所使用的术语“一个（a）”或“一种（an）”应被理解为是指一个或多个该实体。同样地，在本文中可互换地使用术语“一个”（或“一种”）、“一个或多个”、以及“至少一个”。如在本文中所使用的，术语“包含（c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因的方法，所述方法包括步骤：（a）通过包括在所述抗生素的存在下对生长进行选择以产生抗生素抗性突变株克隆的方法产生所述细菌的抗生素抗性突变株（AbR突变株）；（b）用：（i）所述细菌的一个或多个必需基因；以及（ii）插入时使细菌DNA失活的转座子转化所述AbR突变株，以产生对于所述一个或多个必需基因来说是局部二倍体的转座子突变株的库；（c）在不同量的所述抗生素的存在下，使来自所述局部二倍体库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物；以及（d）比较测试培养物之间的转座子插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.05 GB 1107516.51.一种用于识别在细菌内作为抗生素靶标的必需基因的方法，所述方法包括步骤：(a)通过包括在所述抗生素的存在下对生长进行选择以产生抗生素抗性突变株克隆的方法产生所述细菌的抗生素抗性突变株，将其命名为AbR突变株；(b)用以下来转化所述AbR突变株：(i)所述细菌的所述必需基因的野生型拷贝，以产生具有野生型拷贝和其AbR突变株拷贝的局部二倍体；以及(ii)插入时使细菌DNA失活的转座子，以产生对于所述必需基因来说是杂合的局部二倍体的转座子突变株的库；(c)在不同量的所述抗生素的存在下，使来自所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库的细菌生长以产生两种以上的测试培养物，其中进入作为抗生素靶标的所述必需基因的转座子插入存在于非选择性的所述抗生素的量下，即当必需基因的野生型拷贝与其插入失活的AbR突变株拷贝互补时，而不是在选择性的所述抗生素的量下，即当必需基因的野生型拷贝与其插入失活的突变拷贝不互补时；以及(d)比较测试培养物之间的转座子插入的分布以识别在所述细菌内作为所述抗生素的靶标的推定必需基因。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含至少0.5x105个突变株。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含至少5x105个突变株。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含至少1x106个突变株。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含0.5x106至2x106个突变株。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述杂合的局部二倍体的转座子突变株的库包含1x106个突变株。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每50个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每30个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每25个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每15个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。11.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中用转座子转化获得每10个细菌DNA碱基对至少1个转座子的插入比率。12.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，步骤(b)的所述细菌DNA是基因组DNA。13.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，步骤(b)的所述细菌DNA是质粒DNA。14.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述细菌是革兰氏阳性菌。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述细菌选自粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)和淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)。16.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述细菌是革兰氏阴性菌。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述细菌选自：肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumanii)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、大肠杆菌ST131株、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogene...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维·休·威廉斯，阿瑟·基思·特纳，
申请(专利权)人：迪斯库瓦有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB