反向斑点杂交基因芯片及其制造方法技术

本发明专利技术涉及医学体外诊断技术，具体地讲是一种反向斑点杂交基因芯片。它是在尼龙膜上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定有常见的术后颅内感染致病菌的特异性探针。可以鉴定包括：肠球菌(屎肠，粪肠)、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎伯雷克、绿脓杆菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌。还包括有革兰氏阴性细菌通用探针、革兰氏阳性细菌通用探针。这种芯片能同时检测多种致病菌存在与否，具有诊断快速准确、特异性高、信息量大的特点，对临床诊断和流行病学筛查都有很大帮助。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学体外诊断
，具体地讲是ー种基因芯片，尤其是ー种用于术后颅内感染快速诊断的，在芯片上设置多种细菌的探针，其中包括开颅手术后患者脑脊液中一些常见病原菌，利用PCR扩增产物进行杂交试验检测、鉴定测试样本。
技术介绍
目前临床实验室采用的传统细菌培养鉴定主要依靠表型鉴定，敏感性低，检测周期长，且受抗生素应用、病原菌自身生理条件等各方面的限制，不能满足临床快速诊断的要求。而且，这种方法的准确性也有一定差异。如常引起院内感染爆发流行的鲍曼不动杆菌，从表型上与醋酸钙不动杆菌、未正式命名的菌种3，13TU难以区分，依赖目前现有的商品化表型鉴定系统均难以区分。临床病例还存在合并多种细菌感染的可能，这也对传统细菌培 养鉴定方法提出了挑战。细菌核糖体RNA(rRNA)是细菌生命的标志，其16s rRNA和23s rRNA基因是以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因中。目前对细菌16s rRNA和23s rRNA基因间区的研究较多，特别是将其应用于细菌的检测。国外20世纪90年代初即有关于利用细菌16s rRNA基因结构特点构建基因芯片，并将其应用于细菌鉴定的报道。该技术以其高通量、快速、准确性高等优点为解决上述问题提供了一条新的途径，对流行病学和临床状况的认知有提高作用。近年来，国内有人致力于寡核苷酸芯片技术用于临床细菌检测的研究，该种芯片以硝酸纤维膜和尼龙膜等不同载体和地高辛、胶体金显色等方法制备。毕春霞等开展了 16SrRNA微型寡核苷酸芯片检测脑脊液病原菌研究，但存在临床常见脑脊液致病菌覆盖不全、杂交时间长等不足，特别是缺少大样本临床验证数据。这可能大大限制了其临床应用价值。目前市场上最主要的基因芯片产品是以点样等方法制备的用于基因表达检测的中、低密度基因芯片。基因芯片的ー个重要发展趋势是芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析的标准化，提高基因芯片的准确性和可靠性。基因芯片技术，无论其反应条件、检测项目、数据分析较单ー项目的分析都更为复杂化，而临床检验要求检测结果更为精确，因此，如何即保证检测高通量，又保证性能优越，是芯片技术的瓶颈问题之一。
技术实现思路
考虑到至少ー个上述问题而完成了本专利技术。具体地，本专利技术的目的是提供一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的基因芯片及其制造方法。本专利技术包括了用于病原体基因检测进行鉴定种、属特异性探针和革兰氏阴性细菌通用探针、革兰氏阳性细菌通用探针，具有快速、灵敏的特点，是现有细菌鉴定技术的巨大突破。具体地，ー种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的基因芯片，其特征在于包括在基质上设置的革兰氏阳性细菌通用探针、革兰氏阴性细菌通用探针、以及鉴定细菌的种、属特异性的探针，其中革兰氏阳性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGGTGCATGGTTGTCGTCA，革兰氏阴性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGCTGCATGGCTGTCGTCA ;所述鉴定细菌的种、属特异性的探针至少一个选自肠球菌CAAACGAACTTGGAGATAG 金黄色葡萄球菌 CAATCGAACCTGGAGATA凝固酶阴性葡萄球菌CCAATCGAACTTGGAGAT大肠杆菌TACCTTTGCTCATTGACGTT肺炎伯雷克TAACCTTGTCGATTGACGTT绿脓杆菌AGTAAGTTAATACCTTGCTGTT阴沟肠杆菌GGTTAATAACCTTGSTSATTG鲍曼不动杆菌GGCTACTTTAGTTAATACCTA。本专利技术针对每种所鉴定细菌种/属的探针有着合理的碱基成分，探针的退火温度在42-43°C之间，相对比较均一，即10种探针和对应的PCR产物杂交时最适宜的温度条件基本一致，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。根据本专利技术另一方面，该基因芯片还包括标记有生物素点的DNA序列(Bio)ATGTCGCATCTGCGTTGGAATC。根据本专利技术另一方面，提供了ー种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的试剂盒，其特征在于包括前述的基因芯片以及各种引物，所述各种引物用于扩增临床样本中的DNA序列，包括扩增革兰氏阴性菌的上游引物 ACTCCTACGGGAGGCAGCA扩增革兰氏阴性菌的下游引物 ATTACCGCGGCTGCTGGC扩增革兰氏阳性菌的上游引物 TGCCTTTGTAGAATGAACC扩增革兰氏阳性菌的下游引物 CTAAAGCTATTTCGGAGAGA。根据本专利技术另一方面，提供了ー种前述基因芯片的制备方法，包括如下步骤DNA探针的制备合成与待测菌种DNA互补的5’末端经过胺基化的DNA片段，从细菌16S或23S核糖体RNA基因区中挑选出特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成出5’末端经过胺基化的DNA片段；固定探针将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上，先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针点到膜上，通过探针末端的胺基与活化膜上的羧基形成共价结合，牢固的将探针固定在膜上；制备基因芯片利用氢氧化钠停止反应，制得基因芯片。根据本专利技术另一方面，提供了ー种前述试剂盒的使用方法，包括以下步骤利用试剂盒中含有特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA ；对扩增后的DNA进行杂交；检测基因芯片上结合的DNA。根据本专利技术另一方面，所述使用方法的具体步骤如下第一歩扩增样品将临床样本中提取的DNA通过PCR反应进行扩增，所用引物的5’端标记有生物素，扩增得到5’端带有生物素标记的DNA产物；第二步杂交 将上述扩增得到的DNA与基因芯片上面分布的DNA探针、Bio进行反应第三步显色在碱性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIT系统显色，肉眼直接观察結果。反向斑点杂交是把寡核苷酸探针固定在膜上，以标记的靶序列和膜上的寡核苷酸探针进行杂交的方法。与正向杂交相比，它仅通过一次杂交即可确定已知存在的不同基因型。本专利技术以尼龙膜为基质，具有很好的弾性，便于生产和操作；利用反向斑点杂交技术，把寡核苷酸探针固定在膜上，以标记的靶序列和膜上的寡核苷酸探针进行杂交，大大缩短了杂交时间，増加了检测准确度，只需要4小时左右出检测报告，显色结果的背景干净。本专利技术适用于从脑脊液等临床标本中直接提取病原菌DNA用于PCR扩增，靶基因用于杂交检测。基因芯片具有诊断准确、特异性强、信息量高的特点，可以快速、准确，全面的鉴定各种细菌。首先，它用PCR的方法扩增细菌靶基因，避免了费时的培养阶段；其次，基于DNA-DAN的杂交鉴定方法较基于生理和生化的鉴定方法更准确，不受培养条件和细菌生理状态的影响；脑脊液标本特殊，正常是无菌环境，无论细菌“死活”，基因芯片检测结果均提供重要临床价值。随着特异性探针数量的增多，其对更多的样本或混合感染的样本进行检测的能力也将越来越高，检测时间会越来越短，这将为临床细菌的诊断提供ー种全新、快速、灵敏的方法，在某种程度上取代传统细菌检测鉴定方法。附图说明图I是表示基因芯片上探针和监控点的类型和具体的分布位置图，数字代表不同的菌种/属，Bio代表标记有生物素点的DNA序列。图2a表不肠球菌分析结果的图。图2b表不金黄色葡萄球菌分析结果的图。图2c表示凝固酶阴性葡萄球菌分析结果的图。图2d表示大肠埃希氏菌分析结果的图。图2e表示肺炎克雷伯菌分析结果的图。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的基因芯片，其特征在于包括在基质上设置的革兰氏阳性细菌通用探针、革兰氏阴性细菌通用探针、以及鉴定细菌的种、属特异性的探针，其中革兰氏阳性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGGTGCATGGTTGTCGTCA，革兰氏阴性细菌通用探针的核苷酸序列为GGTGCTGCATGGCTGTCGTCA ;所述鉴定细菌的种、属特异性的探针至少一个选自 肠球菌CAAACGAACTTGGAGATAG2.根据权利要求I所述的基因芯片，其特征在于还包括标记有生物素点的DNA序列(Bio)ATGTCGCATCTGCGTTGGAATC。3.一种用于开颅手术后患者脑脊液中病原菌快速筛查的试剂盒，其特征在于包括权利要求I或2所述的基因芯片、以及各种引物，其中所述各种引物用于扩增临床样本中的DNA序列，包括 扩增革兰氏阴性菌的上游弓I物ACTCCTACGGGAGGCAGCA 扩增革兰氏阴性菌的下游弓I物ATTACCGCGGCTGCTGGC 扩增革兰氏阳性菌的上游弓I物TGCCTTTGTAGAATGAACC 扩增革兰氏阳性菌的下游弓I物CTAAAGCTAITTCGGAGAGA。4.一种权利要求I或2所述的基因芯片的制备方法，包括如下步骤 DNA探针的制备合成与待测菌种DNA互补的5’末端经过胺基化的DNA片段，从细菌16S或23S核糖体RNA基因区中挑选出特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计并合成出5’末端经过胺基化的DNA片段； 固定探针将上述探针固定在活化处理好的尼龙膜上，先对尼龙膜进行活化处理，然后将探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：康熙雄，周建新，刘志忠，王强，石广志，
申请(专利权)人：康熙雄，周建新，刘志忠，王强，石广志，
类型：发明
国别省市：