本发明专利技术描述了一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。利用磁珠连接的脱氧核酶与目标物let7a杂交后，可以切断let7a；利用切断后的产物，进行两次剪切聚合的循环，实现信号的放大；利用剪切聚合后的产物进行环介导放大反应，嵌插荧光试剂进行荧光检测，可以计算let7a的浓度。该方法选择性好，灵敏度高，是检测肿瘤标志物let7a的理想方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及剪切聚合反应和环介导反应，是一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。
技术介绍
癌症是全球性的医学难题，卫生部报告:我国每年新发癌症病例220万，因癌死亡160万，防治癌症的任务异常艰巨。防治癌症的最好办法是早期诊断、早期治疗。但是目前所使用的检测方法存在特异性和灵敏度不够高，容易导致假阳性和假阴性结果。因此迫切需要构建高灵敏的检测方法，进行关键技术的攻关创新。肿瘤标志物是反映肿瘤存在和生长的化学物质，临床上通过对这些化学物质的检测，可以对相应肿瘤作早期诊断、疗效评估和预后判定。目前，有多种肿瘤标志物应用于临床，但大多数标志物仍然缺乏足够的组织特异性和肿瘤特异性。微小核糖核酸(microRNA)是近年来发现的一种内生的、非蛋白编码的核糖核酸，长度约为22个核苷酸左右,可通过转录后调控祀基因的信使核糖核酸(mRNA)的翻译，在基因表达调节方面扮演着重要的角色。随着microRNA研究的深入，大量文献报道microRNA与肿瘤的发生发展有着密切关系，所以microRNA作为一种有潜力的肿瘤标志物，可以用来进行癌症的早期诊断。MicroRNA的检测不仅对于microRNA的生物功能的研究,而且对于临床诊断都具有重要的意义。let7a作为较早被发现的let7 microRNA家族中的一种已被证实参与多种肿瘤的细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为，包括肺癌、卵巢癌和淋巴瘤等。目前，let7a的检测方法主要有:RNA印迹法、微阵列法、纳米粒子标记法、生物荧光法、电化学方法等。这些方法普遍存在的问题是，灵敏度不高，特异性不够高，因为let7a存在同源的多种microRNA，如let7b、let7c、let7d等，它们的结构与let7a只差一个或者几个碱基，不容易区分。本方法利用脱氧核酶剪切，解决特异性的问题；利用多重放大技术，解决灵敏度的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，该方法具有选择性好、灵敏度高等特点，适用于肿瘤标志物let7a的检测。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为，操作如下: (1)磁珠连接的脱氧核酶(DNAzyme)与let7a杂交。在一定条件下，let7a被剪断。一段进入溶液，剩余的杂交的let7a部分，可以在聚合酶和剪切酶的作用下进行剪切聚合反应，产生大量的单链脱氧核糖核酸1 (S1); (2 )在(1)的基础上产生的S1可以与另一连接磁珠的单链脱氧核糖核酸2 (S2 )杂交，进行下一个剪切聚合的循环，产生大量的单链脱氧核糖核酸3 (S3)； (3)在(2)的基础上产生的S3，55-60°C下，加入单链脱氧核糖核酸4 (S4)、模板(S5)和聚合酶可以弓I发环介导反应，产生大量的带茎环结构的DNA ； (4)加入荧光试剂SYBR-1，嵌插入(3 )中产物中，可以进行荧光检测。本专利技术的优点: 1、本专利技术选择与let7a杂交的脱氧核酶，可以实现高的选择性，let7a同源家族的microRNA很难剪断，避免干扰。2、将磁珠引入步骤(1) (2)中，方便进行磁分离。3、采用多重放大技术，let7a的检测限可低至10 lsmol/L。【附图说明】图1为检测let7a的原理图。图中，S3是两次聚合剪切得到产物，用来作为环介导反应的引物1，S4是另外加入的环介导反应的引物2。环介导反应的温度是55-60°C。【具体实施方式】以下为实施本专利技术的具体示例，其作用在于进一步阐明本专利技术的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本专利技术要求的保护范围的限定或限制。实验条件: 荧光分光光度计，磁珠，荧光试剂SYBR I，phi29 DNA聚合酶、BST聚合酶，Tris-HCl缓冲液、DEPC处理的水等。具体操作过程:磁珠接DNA:磁珠1接let7a脱氧核酶，磁珠2接S2。羧基化的磁珠，用缓冲液洗三次，加入imidazol-HCl和EDC活化磁珠的羧基，37°C,30min ;用？83 buffer洗三次，重新悬浮，加入氨基化的DNA，37°C过夜；用？83 buffer洗三次，重新悬浮在PBS buffer中，4°C贮存待用。37°C，在PBS缓冲液中，实现接let7a脱氧核酶与let7a的杂交，实现let7a链的剪切，从剪切处开始聚合反应，开始实现剪切聚合的重复反应，产生大量的S1 ； 如图1所示，产生的S1会和接磁珠的S2杂交，加入DNA聚合酶，进一步发生剪切聚合反应，产物是S3 55°C下，体系中加入两端带茎环结构的模板，Bst聚合酶，dNTPs，缓冲液，S3会沿着模板进行链取代，然后加入另一引物S4，会持续不断的引发链取代反应，产生大量的带由单链折叠而成的双链结构的DNA。加入荧光染料SYBR Green I。这是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的突光，但一旦与双链DNA结合后,突光大大增强。可以根据突光信号检测出体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。【主权项】1.，其特征在于: (1)磁珠连接的脱氧核酶，能够特异性的切断与之杂交的靶let7a，避免同源微小核糖核酸的干扰； (2)在(1)的基础上进行剪切聚合循环，产生大量的单链脱氧核糖核酸； (3)在(2)的基础上，引发环介导反应，产生大量带茎环结构脱氧核糖核酸； (4)在(3)的基础上,嵌插突光试剂，进行突光信号的检测。2.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于:采用磁珠连接脱氧核酶和单链脱氧核糖核酸进行剪切聚合的循环，方便进行分离。3.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于:剪切聚合反应的温度为37°C，环介导反应的温度在55-60°C。4.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于:嵌插的荧光试剂为核酸染料SYBR Green I。【专利摘要】本专利技术描述了一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。利用磁珠连接的脱氧核酶与目标物let7a杂交后，可以切断let7a；利用切断后的产物，进行两次剪切聚合的循环，实现信号的放大；利用剪切聚合后的产物进行环介导放大反应，嵌插荧光试剂进行荧光检测，可以计算let7a的浓度。该方法选择性好，灵敏度高，是检测肿瘤标志物let7a的理想方法。【IPC分类】C12Q1/68【公开号】CN105274194【申请号】CN201410749658【专利技术人】郑向江, 吴从从, 张书圣 【申请人】临沂大学【公开日】2016年1月27日【申请日】2014年12月10日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a检测方法，其特征在于：（1）磁珠连接的脱氧核酶，能够特异性的切断与之杂交的靶let7a，避免同源微小核糖核酸的干扰；（2）在（1）的基础上进行剪切聚合循环，产生大量的单链脱氧核糖核酸；（3）在（2）的基础上，引发环介导反应，产生大量带茎环结构脱氧核糖核酸；（4）在（3）的基础上，嵌插荧光试剂，进行荧光信号的检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑向江，吴从从，张书圣，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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