本发明专利技术公开了检测口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒及方法(FMD?NSP?B-ELISA)，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100×浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了6×组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6×组氨酸标签的口蹄疫病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获；本方法与其他同类试剂盒相比有较高的符合率，而且本方法有更高的阳性血清检出率，适于检测牛、羊与猪等多种易感动物血清。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA(FMDVNSPB-ELISA)试剂盒及方法，属于生物
技术介绍
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-andnouthdisease virus, FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种烈性传染病。由于其发病率极高，严重影响畜牧业生产和国际贸易，因而受到各国的高度重视。口蹄疫防控主要采取疫苗免疫和屠宰感染和可疑畜的综合性防控措施，而疫苗免疫动物与感染动物都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法很难区分疫苗免疫动物与感染动物。目前畜牧业生产中使用的口蹄疫疫苗主要是灭活疫苗，灭活疫苗在纯化的过程中除去了大部分非结构蛋白，免疫动物不产生非结构蛋白抗体。自然感染动物体内有病毒复制，既产生非结构蛋白抗体又产生结构蛋白抗体，因此学者们认为检测非结构蛋白抗体对于区别免疫动物与感染动物具有重要意义。在FMDV几种非结构蛋白中，3D是最早用于诊断的非结构蛋白，但后来从疫苗免疫动物的体内也检测到3D抗体，说明3D蛋白不能区分感染动物和疫苗免疫动物。Mezencio等证明感染牛和猪体内的非结构蛋白2C抗体减少速度快于3ABC抗体减少速度，而疫苗免疫牛体内有时也能检测到2C的抗体。Macka/2]等人发现所有试验感染的有临床症状的动物，I个月能检测到3ABC抗体，I年后3ABC抗体仍为阳性，而亚临床感染动物，2个月后仅有80%动物能检测到血清阳性，从而得出3ABC抗体水平与临床症状之间正相关的结果。Bergmann等M比较了 3A、3B、2C、3D和3ABC作为诊断抗原，应用间接ELISA试验检测感染牛的敏感性和准确性，结果3ABC效果最好。现在各国学者以达成共识，检测非结构蛋白3ABC或者3AB抗体是确认动物是否感染FMD的最佳方法。在口蹄疫的诊断过程中，人们逐渐认识到ELISA与其他免疫学检测技术相比具有灵敏、特异、廉价、快速、稳定且易于实现自动化操作等优点，因此不仅适用于大量临床标本的检测，也适合血清流行病学调查。ELISA方法分不同的类型，通过间接法包被抗原发展的阻断ELISA或竞争ELISA又较一般的间接ELISA更为敏感与特异；本专利所描述的方法即是采用间接包被抗原的单克隆抗体阻断ELISA方法，属于ELISA方法中较为先进的反应模式。其特点在于，一是采用间接捕获法包被抗原，可以采用单克隆抗体或者单特异性多抗包被，消除了直接包被抗原所产生的非特异性反应，而且可以更好的展示抗原结构，有利于抗原与抗体的特异性结合；二是利用单克隆抗体(McAb)具有高度均质性和高度特异性的特点，以特异性单克隆抗体作为检测抗体，则使得该方法更加特异与敏感，而且可以用于检测牛、羊、猪以及野生反刍类动物等多种易感动物的血清，不同于间接ELISA方法，每种动物血清都要配备相应的酶标抗体。因此，本专利相对间接ELISA方法而言具有在方法学上的 优越性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA(FMDV NSP B-ELISA)试剂盒及方法。检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA试剂盒，包括酶标反应板、血清稀释液、25倍浓缩洗涤液、底物溶液、100X浓缩酶标检测抗体、终止液、阳性对照血清和阴性对照血清；所述酶标反应板为两块96孔高亲合力酶标板，先包被了 6X组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多克隆抗体，并通过单抗或多抗将原核表达的带6X组氨酸标签的口蹄疫病毒3ABC或2C3AB非结构蛋白捕获；所述血清稀释液含10 %马血清，0.25%酪蛋白，I %海藻糖，0.01%硫柳汞的0. OlM磷酸盐(PBS)溶液；所述25倍浓缩洗涤液500mL超纯水中加NaCl 200g、KCl 5g、Na2HPO4 12H2072. 5g、KH2P045g 和 12. 5mL 吐温 20，补超纯水定容至 IOOOmL, pH 为 7. 4，高压灭菌，室温存放备用；所述底物溶液为单组份3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)底物；所述100X浓缩酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的口蹄疫病毒3B非结构蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体针对3B蛋白中24gpyagpmer32位表位，是3B蛋白中的自然优势抗原表位，不同血清型病毒之间相对保守；通过将HRP标记的3B单克隆抗体稀释于抗体保存液中制备；所述终止液0. 3M H2SO4溶液，利用超纯水稀释分析纯浓硫酸配制而成；所述阳性对照血清采自口蹄疫病毒感染后I 3个月的牛、羊或猪，经检测，非结构蛋白抗体与结构蛋白抗体均为阳性，经无菌处理后加保存剂制备；所述阴性对照血清采自非免疫健康牛、羊和猪，经检测口蹄疫病毒结构蛋白与非结构蛋白抗体均为阴性，经无菌处理后加保存剂保存。检测口蹄疫非结构蛋白抗体的单克隆抗体阻断ELISA方法，包括以下步骤Al、于血清稀释板中，将待测血清按I : 5比例稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入IOOii L，室温过夜振荡作用18-24h ；A2、次日，用I XPBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；A3、将100X浓缩的酶标检测抗体I : 100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100iiL，37°C作用I小时；A4、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入IOOii L的底物溶液，37°C作用10_15分钟，再底物作用过程中，要注意掌握显色程度，加终止液之前可以通过测定650nm吸光值来确定显色程度，于OD65tl值接近0. 7时终止反应，检测效果最佳；A5、加终止液，每孔IOOii L，轻振混匀，于10分钟内用酶标仪读450nm吸光值(OD45O)；A6、阻断率计算阻断率(PI) = I-样品OD450/阴性对照OD450 ； A7、试验成立的条件阴性对照OD45tl值-阳性对照OD■值彡0. 8，且阳性对照阻断率应彡60% ； AS、判定标准牛、羊与猪血清阻断率大于或等于0. 46判为非结构蛋白抗体阳性，血清阻断率小于0. 46判为非结构蛋白抗体阴性。使用组氨酸单克隆抗体或非结构蛋白2C多抗作为捕获抗体，口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体作为检测抗体，原核表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC或2C3AB作为抗原，建立了一种检测口蹄疫非结构蛋白3ABC或2C3AB抗体的阻断ELISA。使用该方法检测了大量牛、羊及猪的血清，并用公式(I-样品OD值/阴性对照OD值)来计算血清阻断率，最终确定牛、羊与猪血清阻断率大于或者等于0. 46判为阳性，血清阻断率小于0. 46判为阴性。根据此标准检测健康动物血清的特异性> 99. 2%，对感染后3 230天牛血清检测敏感性为90. 4%。本方法与其他同类试剂盒相比有较高的符合率，而且本方法有更高的阳性血清检出率。附图说明图I.不同血清稀释度对应阳性标准血清阻断率对比分析2.不同温度与作用时间下对应阳性血清阻断率对比分析3.牛血清样品阻断率统计4.羊血清样品阻断率统计5.猪血清样品阻断率统计6.三种方法检测两只羊抗体持续时间结果对比图.I 24号与25 48号血清分别对应于40本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：卢曾军，刘在新，曹轶梅，付元芳，孙普，李冬，包慧芳，李平花，白兴文，陈应理，谢宝霞，厍大亮，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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