猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体和抗原及其制备制造技术

本发明专利技术涉及猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体和抗原及其制备方法。本发明专利技术将猪传染性胃肠炎病毒在猪睾丸细胞上增殖后作为免疫原，用于免疫非免疫蛋鸡，在收集卵黄并提纯的基础上获取了可用于治疗和预防猪传染性胃肠炎病毒的卵黄抗体。使用本发明专利技术的卵黄抗体治疗试验攻毒猪，试验组临床症状比对照组明显减轻，且试验组的死亡率显著低于对照组。将本发明专利技术提供的卵黄抗体在猪传染性胃肠炎高发病率的猪场实地应用，也产生了明显的预防和治疗作用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的抗体和抗原及其制备方法。目前对该病的防治尚无特别有效的手段。可行的治疗方法仅是对症治疗，减少饥饿、脱水和酸中毒。关于TGEV的免疫预防报道较多，既有使用TGEV强毒或弱毒的主动免疫，也有饲喂含TGEV抗体乳汁的被动免疫(Porter P.，Allen W.D.Classes of immunoglobulinsrelated to immunity in the pigA review.J.AM.Vet.Med.Assoc.1972，160511-518)，还有新型亚单位疫苗、重组活载体疫苗等。鉴于TGEV在肠道内吸附和增殖，猪传染性胃肠炎发生与否与肠道局部免疫水平的高低密切相关，因而肠道的局部免疫对防治TGEV尤为重要，分泌型IgA水平的高低往往反映免疫的效果，目前使用的TGEV疫苗免疫猪体后血清抗体水平可能很高，而肠道局部免疫水平较差，不能达到阻止TGEV感染的目的。而乳汁免疫虽能保护初生仔猪抵抗TGEV的感染，但断乳后即失去保护力。卵黄抗体可抵抗幼龄动物的胃酸屏障，抵抗肠道中胰蛋白酶和凝乳蛋白酶的消化。该种抗体效价维持时间长，化学性质稳定，可耐热、酸、碱，4℃可长时间存放。卵黄抗体还具有制备过程较血清抗体简单、省时省力、产量高、成本低、易于获得和提纯等许多优点。病毒免疫原免疫鸡体后通常在卵黄内产生高效价的抗体，而免疫家兔等用于制备血清抗体通常抗体效价高，收获血清抗体量较少，成本较高。(Ntakarutimana V.，DemedtsP.，Sande M.V.et alA simple and economical strategy for downstream processing of specificantibodies to human transferring from egg yolk.J.Immun.Meth.1992，153133-140。BizhanovG.，Vyshniauskis GA comparison of three methods for extracting IgY from the egg yolk of hensimmunized with Sendai virus.Vet.Res.Comm.2000，24103-113。罗函禄高免卵黄抗体的应用及其展望.江苏农业科学.1997，559-63)。但猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是研制一种抗TGEV卵黄抗体，该抗体经口服后可直接作用于动物的肠道，从而达到阻止TGEV在肠道吸附和增殖的目的。本专利技术的技术方案是将猪传染性胃肠炎病毒经猪体内复壮后在猪睾丸细胞上增殖，用于制备免疫原，免疫非免疫蛋鸡，收集卵黄进行卵黄抗体效价检测，选择高效价的卵黄提纯卵黄抗体。该抗体经口服后直接作用于仔猪肠道，以治疗和预防TGEV感染。具体方法为一.TGEV抗原制备1.仔猪哺育与攻毒给1日龄未吃初乳仔猪口服TGEV病毒液，48小时后捕杀仔猪，取出全部小肠组织，用于提取和纯化TGEV。2.TGEV提取与纯化将小肠组织剪碎后充分研磨，加0.01MPBS(pH7.5)稀释，反复冻融，离心，取上清液加入6％PEG-6000和2％NaCl，放置后再离心，将沉淀重悬于PBS中，离心后取上清液进行超速离心。将沉淀重悬于PBS中，即为纯化病毒粒子。3.TGEV在细胞上增殖用MEM培养液(含5％犊牛血清)培养猪睾丸(ST)细胞，当细胞单层长至75％以上时，取超速离心纯化病毒接种于细胞单层上，并加入胰酶以利于病毒的吸附，若72小时后感染细胞病变(CPE)不明显，则收获细胞悬液反复冻融后离心取上清液继续在细胞上盲传，盲传至第三代开始出现CPE，此时大量感染细胞，收获细胞悬液，反复冻融后离心，上清液经浓缩后用作抗原。二.卵黄抗体制备1.动物免疫(1)免疫准备将上述浓缩抗原液蛋白用PBS稀释，与等量弗氏完全佐剂乳化后作为首免用免疫原；与等量弗氏不完全佐剂乳化后作为二免、三免及四免用免疫原。(2)免疫用上述制备的免疫原对非免疫产蛋鸡进行免疫，另设不免疫的空白对照组，在普通鸡舍内按常规方法饲养。免疫程序为首免前5日对每只鸡胸肌多点注射0.5ml“吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素”混合制剂，以刺激机体免疫反应。首免时每只鸡胸肌多点注射免疫原1ml，两周后进行二免(与初免时免疫量相同)，再隔两周进行三免(免疫量加倍)，再隔一个月后进行第四次免疫(免疫量再加倍)。2.卵黄液制备二免后一周开始收集所产鸡蛋，分离出卵黄，与等量PBS混合后匀浆，制备成卵黄液以进行下步测定抗体效价。3.抗体效价检测得到的TGEV卵黄抗体通过琼脂扩散试验中的抗原抗体反应进行证明。(具体方法参照兽医免疫学实验指导，南京农业大学主编，上海科学技术出版社，1984)。琼脂扩散中检测抗原为超离提纯的病毒，因为产蛋鸡免疫用的免疫原来自细胞感染物，其中不纯成分可能为细胞碎片，而检测抗原中没有细胞成分，若该检测抗原与卵黄抗体发生反应，可证明卵黄抗体中含有针对检测抗原即TGEV的抗体。制备琼脂凝胶将卵黄抗体液用PBS倍比稀释后加入琼脂凝胶周围孔中，中间孔中加入经超速离心纯化的抗原，置湿盒中于37℃温箱反应24小时，以出现阳性沉淀带的最高稀释度卵黄液为该卵黄液的抗体效价。检测结果二免后一周采集卵黄检测效价为1∶8，再收集卵黄一个月抗体效价达到高峰1∶64。抗体效价实验数据进一步证明了卵黄抗体活性的高低。4.卵黄抗体提纯卵黄抗体提纯采用聚乙二醇(PEG-6000)沉淀法。(方法参见Polson A.，etal.Improvement in the isolation of IgY from the yolks of eggs laid by immunized hens.Immun.Invest.，1985，14(4)，323-327)。5.将提纯的卵黄抗体液冻干，贮存于4℃。三.TGEV卵黄抗体治疗试验实验动物为1日龄未吃初乳仔猪。试验组动物用TGEV病毒口服攻毒，然后口服饲喂本专利技术的卵黄抗体。另设攻毒未用抗体组、不攻毒未用抗体组、不攻毒用抗体组3组作为对照。根据各组临床症状及死亡率来判断TGEV卵黄抗体的治疗效果。试验结果表明本专利技术提供的TGEV卵黄抗体对TGEV引起的仔猪腹泻具有明显的治疗作用，未出现任何毒副作用。表1 免疫鸡每隔两周血清抗体和卵黄抗体效价测定结果 免疫鸡血清抗体和卵黄抗体效价比较结果显示(1)血清抗体和卵黄抗体效价变化一致，随免疫原加强免疫抗体的效价逐渐升高，通常三免后一周达到高峰，然后逐渐降低，此时四免使抗体效价达到更高的水平；(2)两种抗体效价仅在某一时间段内有差异，但两者总的变化趋势无显著差异；(3)免疫后血清抗体效价先上升，至一定水平后下降也较快；卵黄抗体效价变化较慢，但达到一定水平后常维持一段时间，下降较慢；(4)从每只鸡抗体变化曲线看，抗体效价在不同免疫个体间存在差异某些个体免疫后抗体上升很快，而有些则需较长时间才能达到较高的抗体水平。结论测定血清抗体效价能够反应卵黄抗体效价的变化动态；为得到高效价的卵黄抗体，至少应免疫三次，增加免疫次数可使高效价卵黄抗体维持较长时间。2.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体，其特征是该抗体是将猪传染性胃肠炎病毒作为人工抗原用于免疫非免疫产蛋鸡，收集该被免疫的鸡所产鸡蛋，从其蛋黄中提取的猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王金洛，徐福州，杨兵，宋维平，赖平安，秦泽云，
申请(专利权)人：北京市农林科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]