本发明专利技术公开了一种检测禽流感病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及引物。一组检测禽流感病毒的引物，为序列表SEQ?ID?No：1和序列表SEQ?ID?No：2所示的寡核苷酸序列。本发明专利技术的优点是：首次将新型恒温扩增技术HDA应用于禽流感病毒的检测中，与AIV现有的检测方法相比：①HDA检测方法更快、更便捷，安全可靠。传统的病毒分离和血清学方法耗时较长，且存在生物安全危险性；HDA方法模仿体内天然的复制机制，安全性高，且反应快速，最多仅需2h即可完成检测；②与荧光PCR相比，程序设定更简单，不需要摸索退火温度等反应条件，从技术层面上讲更便于掌握和操作。且通过反应条件的优化，实时荧光RT-HDA方法最低可检测至10个拷贝/反应的病毒核酸。这项技术在禽流感病毒的监控和诊断中都具有极大的应用前景，是一种极具推广应用价值的诊断工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测禽流感病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒及引物，属于检验检疫领域。
技术介绍
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病综合症。禽流感历史悠久，第一次发现是1878年,Perroncito首次报道禽流感在意大利发生，已被国际兽医局(OIE)列为A类烈性传染病，世界卫生组织(WHO)认为Al是对人类造成潜在威胁的最主要的疾病之一，我国也将高致病性禽流感(HPAI)列入一类动物传染病进行防制。近些年来，我国很多地区都存在禽流感的流行，给养禽业带来 不同程度的打击，迄今为止已经发生多起高致病性禽流感感染人致死的事件，对养殖业发展和人类健康造成巨大威胁。目前，全世界已有15个国家和地区发现禽流感人类感染病例，死亡率高达60%以上。因此，建立禽流感快速检测技术，将对禽流感的监测与防控发挥重要作用。目前，我国使用的禽流感检测标准有2项行标和7项国标,主要检测方法有病毒分离、各类血清学试验及免疫学试验(琼扩、血凝血抑、ELISA)、分子生物学检测方法(RT-PCR和荧光RT-PCR)等。但是，每种检测方法均存在一定的局限性。传统的病毒分离和血清学方法繁琐耗时，不适于流行病学普查和高通量口岸检疫。PCR和荧光PCR方法已经得到广泛应用，并在疾病检测和过境检疫中发挥了重要作用。但是，传统的PCR技术仍然存在一些不足需要昂贵的设备，尤其是荧光PCR仪造价不菲；容易受到多种因素的影响；扩增时间往往需要几个小时。上述问题使得传统的PCR技术难以在基层推广应用，不利于疾病的“早发现、早报告、早处理”。近年来，分子诊断技术日新月异，产生了多种新型分子扩增技术，推动着分子诊断技术向操作简单、仪器要求不高的方向发展。其中，依赖解旋酶恒温基因扩增技术(Helicase-Dependent Isothermal Amplification,HDA)是 2004 年 BioHelix 的研究人员模拟动物体内DNA的复制机制专利技术的一种新的体外恒温扩增技术。该技术利用DNA双链解旋酶打开双链DNA，同时在单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶的作用下，扩增靶片段，实现目的基因的体外扩增。此外，实时荧光定量检测病原技术是近些年来应用越来越广泛的一种检测方法。使用SyberGreen荧光染料，结合溶解曲线的分析，可对荧光PCR进行实时定量检测。若将荧光定量方法与HDA技术结合，建立实时荧光RT-HDA方法，则能将两种技术的优势发挥至最大。实时荧光RT-HDA技术的优势I. HDA技术与普通PCR技术相比，具有很多优势。HDA技术的引物设计比较简单易学，由于是恒温扩增技术，不论检测何种病原均可使用同一种反应温度，因此，即可在同一条件下分管同时检测不同的病原，也可建立多重HDA方法同时检测多种病原，不需要特意将不同扩增片段的退火温度设计成一样。此外，由于体系中使用了耐高温的BstDNA扩增酶，使得HDA技术具有更高的特异性和敏感性。HDA技术与其他恒温扩增技术相比，是一种真正的恒温扩增方法，完全不需95°C变性，因而，该技术不需要PCR仪，操作简单方便，非常适合基层检测和现场快速诊断。2.本专利技术使用EvaGreen作为实时定量HDA方法中的DNA结合染料。EvaGreen是一种可结合于双链DNA小沟中的荧光染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。该染料的诸多优点使它远胜于目前常用的SYBRGreen I。除了有相似的光谱特性，EvaGreen有三个主要特点使它区别于SYBRGreenI:①EvaGreen对PCR的抑制性远小于SYBRGreen I，因此，使用EvaGreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时，EvaGreen在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于SYBRGreen I的扩增信号。较高浓度的EvaGreen也消除了 “染料重分布”的缺陷，使EvaGreen既可用于多重PCR,也可用于高分辨率(高清晰)熔解曲线分析(HRM)。②EvaGreen的稳定性极强。在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBRGreen I不稳定而且降解后对PCR的抑制性更强。③EvaGreen降低了细胞膜透性，因而比SYBRGreen I更加安全。独 立实验室的测试结果显示，EvaGreen既没有诱变性也没有细胞毒性，更符合生物安全要求。3.将EvaGreen荧光染料加入HDA反应体系，建立实时荧光HDA技术，利用S型扩增曲线结合溶解曲线分析，可对特定病原核酸进行检测。实时荧光HDA的反应程序设定简单、操作方便快捷，不仅进一步提高原有HDA方法的灵敏度，还能对检测过程进行实时监测，可在更短的时间内得知样本的检测结果。使用标准品建立标准曲线，还可对样品进行定量检测。总之，与同类新型PCR技术相比，实时荧光HDA技术更简单高效，具有灵敏度高、特异性强、快速诊断、高通量、操作简单、重复性好、自动化程度高、易标准化操作和试验的生物安全性高等突出优点，灵敏度比普通PCR灵敏度高100倍以上，能够最大限度的避免交叉污染，是一种崭新的基因扩增方法，极具应用价值和市场前景。目前，国际上对于实时荧光HDA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有关于实时荧光HDA检测动物病毒的研究。我们将首次建立起快速检测禽流感病毒的实时荧光HDA技术。该项研究成果将成为动物疫病分子诊断领域的突破性技术，是动物流感检疫技术体系的进一步完善和发展。HDA技术的建立将真正实现简单、便捷的临床和实验室诊断，适用于基层检疫，可全面提升口岸检疫的检测能力，缩短检疫时间，真正实现高通量检测，为我国禽流感的有效防制作出重大贡献。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一组作为引物使用的、检测禽流感病毒的寡核苷酸序列。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测禽流感病毒的试剂盒。为解决第一个技术问题，本专利技术采用以下技术方案一组检测禽流感病毒的引物，为序列表SEQ ID No : I和SEQ ID No :2所示的寡核苷酸序列，详见表I。表I.引物序列~I序列(5’ -3’)I序列表编号~引物 I GTAGACGCTTTGTCCAGAATGCCCTAASEQ ID No. I引物 II GACCTCCTTAGCCCCATGGAATGTTATSEQ ID No. 2注胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)。其中序列引物I和引物II分别为检测禽流感病毒的正义引物和反义引物。为解决第二个技术问题，本专利技术采用以下技术方案一种检测禽流感病毒的实时荧光RT-HDA试剂盒，保存于_20°C，由以下试剂组成 (I)TriZol 裂解液；(2) RT-HDA 反应液，其包括HDA 缓冲液、MgS04、NaCl、dNTP、引物 I、引物 II ;进一步地，优选为 IXHDA 缓冲液、3. 5mM MgSO4,40mM NaCl.O. 2ImMdNTP、IOOnM 引物 I、100nM 弓I物II ;其中，IXHDA缓冲液由10XHDA缓冲液稀释制备而成，所述1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测禽流感病毒的引物，其特征在于，该引物序列如序列表SEQ？ID？NO：1至SEQ？ID？NO：2所示，其中SEQ？ID？NO：1为检测禽流感病毒的引物I，SEQ？ID？NO：2为检测禽流感病毒的引物II。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蒲静，刘环，乔彩霞，高志强，汪琳，张伟，谷强，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
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