本发明专利技术公开一种鸭坦布苏病毒、由该病毒制备的疫苗及其制备方法，该病毒命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014‑3；所述病毒于2016年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：V201621；所述治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)病毒培养：将鸭坦布苏病毒GDHD2014‑3接种至病毒培养用细胞中，然后收获病毒液并过滤；2)病毒灭活：将病毒液中加入甲醛溶液灭活24～48h；3)乳化：将疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得疫苗；疫苗中的抗原免疫原性好，采用较低浓度病毒制成疫苗即可起到保护作用，保护率达90％以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种鸭坦布苏病毒及其应用。
技术介绍
鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu Virus Strain)，也称蛋鸭黄病毒病是由黄病毒科鸭坦布苏病毒引起的一种侵害蛋鸭卵巢的急性传染病。主要引起高产蛋鸭产蛋量急剧下降、采食量急剧下降。如果蛋鸭患此病，其产蛋量可从高峰在一周内迅速下降甚至停产，采食量也从正常水平降低至正常的20％左右。经临床诊断分析，患病蛋鸭卵巢坏死，脾脏肿大，并伴有未成形卵的液化等临床病理特征。本病在国内传播广泛，各省种蛋鸭养殖区每年均有发生。自2010年该病发现以来，从最初的夏季产蛋高峰期爆发发展至现在的不定期发生，该病呈现出了一种无规律的变化，对蛋鸭养殖业危害极大。此病暂无疫苗上市，因此发现具有较好免疫原性的毒株对于蛋鸭黄病毒病的疫苗研制，预防该病的发生有重大的意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种鸭坦布苏病毒(拉丁文学名：Duck Tembusu Virus，DTMUV)，该病毒对细胞的适应性强，病毒生产效率高。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种鸭坦布苏病毒，该病毒命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014-3；所述病毒于201 6年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学内，保藏号为CCTCC No：V201621，分类命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014-3(拉丁文学名：Duck Tembusu vi rus strain GDHD2014-3)，其序列如序列表SEQ No.1所示。本专利技术的第二个目的是为了提供一种治疗鸭坦布苏病毒的疫苗，疫苗中的抗原免疫原性好，小剂量即可起到效果。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种治疗鸭坦布苏病毒的疫苗，由上述的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3制备而得。本专利技术的第三个目的是为了提供一种治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，可抵抗发病剂量鸭坦布苏病毒的攻击而保持产蛋率维持在92.4％以上。实现本专利技术的目的可以通过采取如下技术方案达到：如上所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，所述的疫苗制备包括以下步骤：1)病毒培养：将鸭坦布苏病毒GDHD2014-3接种至含病毒培养用细胞的培养液中，然后收获病毒液并过滤，-20℃保存备用；2)病毒灭活：将步骤1)获得的病毒液中加入病毒液体积1000～10000倍体积的甲醛溶液灭活24～48h；然后在病毒液中加入硫酸铵，搅匀后在温度为4℃的条件下沉淀6～8h，5000rpm离心40min，弃上清，沉淀用灭菌双蒸水悬浮，装于透析袋中，于PBS中搅拌透析6～8h，得到纯 化的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3；将病毒10000rpm离心5～10min，取上清液为疫苗原液；3)乳化：将步骤2)获得的疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得鸭坦布苏病毒GDHD2014-3疫苗。作为优选，步骤1)中，所述病毒培养用细胞为ST细胞、Vero细胞或PK15细胞的其中之一。作为优选，步骤1)中，当培养液的糖分为1～10mmol，pH值为6.5～7.5时，收获病毒液。作为优选，步骤2)中，所述硫酸铵的加入质量与病毒液的体积比为：300～400g/L。作为优选，步骤1)中，所述病毒培养的方法为半灌流式培养方法。作为优选，所述半灌流式培养方法包括以下步骤：Ⅰ)采用双臂细胞培养装置进行病毒增殖：将装有载体的双臂细胞培养装置进行高压灭菌，然后加入培养液，在4～25℃的条件下培养12～36h后置于37℃水浴中20～30min；无菌接入病毒培养用细胞，在37℃，5％CO2的条件下进行细胞扩增培养36～120h；Ⅱ)更换培养液：每天测定培养液中葡萄糖含量以及pH值，当糖分为1～10mmol时，pH值为6.5～7.5时，进行培养液更换；Ⅲ)病毒接种：当病毒培养用细胞数量达到108～1010个时，接入含鸭坦布苏病毒GDHD2014-3的尿囊液，在37℃，5％CO2的条件 下进行病毒扩增培养；Ⅳ)补充培养液：接毒后每天进行葡萄糖含量以及pH值监测，当培养液中糖分为1～10mmol时，pH值为6.5～7.5时，收集体积10～90％的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3病毒液，然后补入等量的新鲜培养液继续培养；Ⅴ)保存：将步骤Ⅳ)收获的病毒液于-100～-20℃，反复冻融1～5次，冻融后离心取细胞碎片、过滤，得到用于接种的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3病毒液，-20℃保存。作为优选，步骤Ⅰ)中，所述培养液包括体积比1～10％的胎牛血清，体积比1～5％青链霉素，体积比1～5％的Hepes液。作为优选，重复步骤Ⅳ)4～6次，将每次的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3病毒液收集混合。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1、本专利技术提供的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3对细胞适应性强，病毒生产效率高；2、本专利技术所述的疫苗中的抗原免疫原性好，采用较低浓度病毒制成疫苗即可起到保护作用，保护率达90％以上；3、本专利技术所述的半灌流式培养方法将鸭坦布苏病毒GDHD2014-3培养4～6代后，病毒滴度达到107.5ELD50/mL，而一般的鸭坦布苏病毒平均需要传代至少30代才可以达到；4、本专利技术所述的半灌流式培养方法，降低生产成本，提高病毒生产效率，每培养一批细胞可以连续收获4～6次鸭坦布苏病毒GDH D2014-3病毒液，收获病毒量为普通培养方式的2.5倍以上，大大降低了病毒的生产成本。附图说明图1为鸭坦布苏病毒GDHD2014-3的电镜图。本专利技术所述的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3，于2016年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学内，保藏号为CCTCC No：V201621，其序列如序列表SEQ No.1所示。具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本专利技术做进一步描述：一种鸭坦布苏病毒，该病毒命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014-3；所述病毒于2016年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：V201621，其序列如序列表SEQ No.1所示。将鸭坦布苏病毒GDHD2014-3用于疫苗的制备，包括以下步骤：一、病毒培养：采用半灌流式培养方法对病毒进行培养，Ⅰ)采用双臂细胞培养装置进行病毒增殖：将装有载体的双臂细胞培养装置进行高压灭菌，然后加入培养液，在4～25℃的条件下培养12～36h后置于37℃水浴中20～30min；无菌接入Vero细胞，在37℃，5％CO2的条件下进行细胞扩增培养36～120h；Ⅱ)更换培养液：每天测定培养液中葡萄糖含量以及pH值，当糖分为1～10mmol时，pH值为6.5～7.5时，进行培养液更换；Ⅲ)病毒接种：当Vero细胞数量达到108～1010个时，接入含鸭坦布苏病毒GDHD2014-3的尿囊液，在37℃，5％CO2的条件下进行病毒扩增培养；Ⅳ)补充培养液：接毒后每天进行葡萄糖含量以及pH值监测，当培养液中糖分为1～10mmol时，pH值为6.5～7.5时，收集体积10～90％的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3病毒液，然后补入等量的新鲜培养液继续培养；重复步骤Ⅳ)4～6次，将每次的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3病毒液收集混合；Ⅴ)保存：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鸭坦布苏病毒，其特征在于：该病毒命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014‑3；所述病毒于2016年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：V201621。
【技术特征摘要】
1.一种鸭坦布苏病毒，其特征在于：该病毒命名为鸭坦布苏病毒GDHD2014-3；所述病毒于2016年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：V201621。2.一种治疗鸭坦布苏病毒的疫苗，其特征在于：由权利要求1所述的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3制备而得。3.如权利要求2所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)病毒培养：将鸭坦布苏病毒GDHD2014-3接种至含病毒培养用细胞的培养液中，然后收获病毒液并过滤，-20℃保存备用；2)病毒灭活：将步骤1)获得的病毒液中加入病毒液体积1000～10000倍体积的甲醛溶液灭活24～48h；然后在病毒液中加入硫酸铵，搅匀后在温度为4℃的条件下沉淀6～8h，5000rpm离心40min，弃上清，沉淀用灭菌双蒸水悬浮，装于透析袋中，于PBS中搅拌透析6～8h，得到纯化的鸭坦布苏病毒GDHD2014-3；将病毒10000rpm离心5～10min，取上清液为疫苗原液；3)乳化：将步骤2)获得的疫苗原液，与白油佐剂混合进行乳化，获得鸭坦布苏病毒GDHD2014-3疫苗。4.如权利要求3所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述病毒培养用细胞为ST细胞、Vero细 胞或PK15细胞的其中之一。5.如权利要求3所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，当培养液的糖分为1～10mmol，pH值为6.5～7.5时，收获病毒液。6.如权利要求3所述的治疗鸭坦布苏病毒的疫苗的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述硫酸铵的加入质量与病毒液的体积比为：300～400g/L。7.如权利要求3所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯晓声，王伟，王贵平，罗梦萍，
申请(专利权)人：广东海大畜牧兽医研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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