一种亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。该疫苗组合物种几种蛋白抗原组合使用，协同刺激机体免疫反应，只需要免疫一次即可产生良好的保护作用，对不同血清型猪巴氏杆菌的混合感染有较好的保护作用。本发明专利技术还提供了该疫苗组合物的制备方法，通过基因工程手段对蛋白抗原进行大量表达产生，利于大规模生产。经试验证明本发明专利技术的疫苗组合物可有效保护猪只抵抗不同血清型猪巴氏杆菌的混合感染，其应用对于提供一种完善预防和/或治疗猪巴氏杆菌感染的途径，和对于净化猪巴氏杆菌有着积极的现实意义。

Subunit vaccine and preparation method and application thereof

The present invention provides a vaccine composition comprising an immune amount of swine Pasteurella antigen OmpA protein, OmpH protein and PlpE protein. The combination of several species of vaccine antigen combination, cooperative immune response and immune only once to produce good protective effect, on different serotypes of Pasteurella multocida infection has better protective effect. The invention also provides a preparation method of the vaccine composition, which can generate a large number of protein antigens by means of gene engineering. The test proved that the vaccine composition of the invention can effectively protect the mixed infection of pigs against different serotypes of Pasteurella multocida and its application to provide a way to improve the prevention and / or treatment of Pasteurella multocida infected pigs, and for the purification of swine Pasteurella multocida has a positive practical significance.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种亚单位疫苗，该疫苗的制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属多杀性巴氏杆菌种，是有荚膜的革兰氏阴性短杆菌，兼性厌氧。根据其荚膜和脂多糖的不同，可将Pm分为A、B、D、E、F5个血清群和16个血清型，A型主要引起禽霍乱，B、E型主要引起出血性败血症，产毒素的D型主要引起猪萎缩性鼻炎。该病原菌在世界各地均有流行，宿主范围较广，可感染多种动物并引起发病，不同动物感染后发病症状和病理变化不尽相同。猪的多杀性巴氏杆菌病多数是由PmA、B、D血清型引起，非产毒素多杀性巴氏杆菌主要引发猪肺疫，又称猪出血性败血症，俗称“锁喉风”。该病最急性型呈败血症症状，咽喉部急性肿胀，高度呼吸困难，犬坐姿势，死亡迅速；急性型表现为纤维素性胸膜肺炎症状；慢性型多为慢性肺炎、胃肠炎以及逐渐消瘦，有时伴发关节炎。产毒素多杀性巴氏杆菌主要引起进行性猪萎缩性鼻炎，该病会导致猪鼻甲骨萎缩、鼻吻变形及全身骨骼发育受到影响，使猪的生长迟缓，容易继发复合性肺炎，给养猪业造成巨大的经济损失。目前临床上用于预防多杀性巴氏杆菌病的疫苗主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗，灭活苗对巴氏杆菌不同血清型的交叉保护能力差、保护期短；弱毒活疫苗的免疫效果易受环境等因素的影响且存在毒力返强的风险。无论是灭活疫苗还是弱毒活疫苗，均需要多次重复免疫，面对异型菌株的攻击，其保护功效是十分有限的。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于克服现有技术缺陷，提供一种用于预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物，包含三种猪巴氏杆菌免疫保护性抗原和佐剂。本专利技术的第一方面包括一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。本专利技术采用大肠杆菌表达的OmpA、OmpH及PlpE蛋白制备猪巴氏杆菌亚单位疫苗，对猪巴氏杆菌不同血清型提供全面的保护；使用吸收效果好的新型水溶性佐剂，避免免疫局部出现不良反应，提高免疫应答及对猪的免疫保护作用。本专利技术首次通过将Pm的外膜蛋白OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白组合使用，针对不同血清型猪巴氏杆菌感染有较好的保护作用，而且只需要免疫一次，避免多次重复免疫带来的应激反应。通过免疫效力比较试验，意外发现，几种蛋白组合使用，协同刺激机体免疫反应，能够有效降低免疫剂量，大大降低免疫成本。本专利技术提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原为P.multocida重组OmpA、OmpH、PlpE蛋白。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.5,所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.6。优选地，本专利技术提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原OmpA蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。优选地，本专利技术提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原OmpH蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。优选地，本专利技术提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原PlpE蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的疫苗组合物中，所述编码猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白的核苷酸序列为SEQ.NO.1,所述编码猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白的核苷酸序列为SEQ.NO.2,所述编码猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白的核苷酸序列为SEQ.NO.3。本专利技术提供的预防和/或治疗猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗组合物包含的猪巴氏杆菌免疫抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白、PlpE蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对猪巴氏杆菌菌株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。术语“片段”指这样的多核苷酸序列，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本专利技术核酸的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。术语“保护性反应”意为在动物中预防猪巴氏杆菌相关疾病或由猪巴氏杆菌导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。本专利技术涉及的猪巴氏杆菌多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本专利技术实施方式的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本专利技术的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对猪巴氏杆菌菌株攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本专利技术的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO：4-6中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的疫苗组合物中，所述猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白含量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为100-400μg/ml。本专利技术的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪巴氏杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪巴氏
杆菌抗原OmpA蛋白、OmpH蛋白和PlpE蛋白。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪巴氏杆菌抗
原OmpA蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.4,所述猪巴氏杆菌抗原OmpH
蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.5,所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白的氨基
酸序列为SEQ.NO.6。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪巴氏杆菌抗
原OmpA蛋白含量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含
量为50-150μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为100-400μ
g/ml。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述猪巴氏杆菌抗
原OmpA蛋白含量为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原OmpH蛋白含量
为100μg/ml，所述猪巴氏杆菌抗原PlpE蛋白含量为...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，金云云，田克恭，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41