一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗及其制备方法，即腐败梭菌、产气荚膜梭菌C型、产气荚膜梭菌D型、气肿疽梭菌四联灭活疫苗。使用该疫苗能够一次免疫预防四种牛羊常见梭菌病，用于牛、羊黑腿病(气肿疽)、恶性水肿(腐败梭菌)、肠毒血症(C、D型)的预防，该疫苗主要成份有气肿疽梭菌和腐败梭菌的灭活菌液、C型产气荚膜梭菌类毒素和D型产气荚膜梭菌类毒素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗及其制备方法。即是一种预防由腐败梭菌、产气荚膜梭菌C型、产气荚膜梭菌D型和气肿疽梭菌引起的牛、羊等反刍动物梭菌病的四联灭活疫苗及其制备方法。属于兽用生物制品领域。
技术介绍
梭菌病是由梭菌属(Clostridium)中致病性菌种引起的疾病的总称。梭菌是厌氧性细菌，有60余种，常见的致病性菌仅10余种，多存在于土壤、污水以及人和各种动物的粪便中。革兰氏染色均为阳性，除少数菌种外，都有鞭毛，能运动和形成芽胞，其直径大于菌体。多数菌种能产生剧烈的外毒素，它既是致病的主要因子，又是主要抗原，转变成类毒素后能刺激动物产生抗毒素，可用于预防相应的梭菌病。梭菌病发病迅速、病程短、死亡率高。家畜中多见于反刍动物如牛、羊等。专性厌氧菌气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)能够引起牛、羊气肿疽。牛的自然感染多半经过消化道，个别经过体表创伤感染。绵羊大多是创口感染，但不多见。潜伏期一般为3～5天。病畜常突然发病，精神沉郁，停止反刍，体温升高，随之出现上述特征症状。腐败梭菌(Clostridium septicum)引起的恶性水肿是一种急性传染病，多数散发，反刍兽中以绵羊最为易感。有时呈流行性发生。单蹄兽也能感染，肉食动物和家禽少见。由外伤感染的称恶性水肿；由消化道感染的称快疫，绵羊所患多属后者，死亡很快。人也可感染，多为外伤感染，一般称气性坏疽。外伤感染的伤口周围发生弥漫性炎性水肿，开始时坚实、灼热、疼痛，然后无热无痛，手压松软。随着炎性水肿的发展，病畜全身症状加剧，呼吸困难，粘膜发绀，脉搏细小，体温上升，有时发生腹泻，可于半天至3天内死亡。经消化道感染的病羊突然发病，行走时后肢摇摆，头颈向后弯曲，磨牙，口鼻流出泡沫，痉挛倒地，迅速死亡。在人和动物肠道中，产气荚膜梭菌是正常菌群之一，可以引起人的食物中毒、肠毒血症、坏死性肠炎腹泻，所有种类的产气荚膜梭菌都可能造成成年奶牛和犊牛的肠道综合症。此类细菌同时也会感染人类和其它动物，包括猪，鸡以及羊。尽管产气荚膜梭菌有很多不同的亚型(A～E亚型)，会分泌不同的毒素并造成不同的病症，但不同亚型导致的临床症状和致病因子会有部分重叠，因此并没有做出明确的区分。产气荚膜梭菌广泛存在于自然环境和大部分哺乳动物的胃肠道中。C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfrinens type C)能够引起猝狙。本病病原与肠毒血症的病原属于同属同种细菌，但菌型不同。病原菌经口感染，在消化道繁殖而产生毒素。突然发病，病程短促，几乎观察不到症状即告死亡，生前不易确诊。产气荚膜梭菌C会造成新生犊牛肠道坏疽。患病犊牛很可能在表现出腹泻症状前就已经死亡。D型产气荚膜梭菌(Clostridium perfrinens type D)能够引起肠毒血症。主要危害绵羊，尤以膘情好的2岁以下绵羊为甚。山羊少见。病畜死亡迅速，死后剖检肾脏多呈软化，故又称软肾病。由消化道感染，饲料中纤维含量少和蛋白质精料过多时更易发病，因而也称“过食症”。症状与猝狙类似。产气荚膜梭菌D会造成典型的过食，羔羊比犊牛更容易感染这种综合症。通常会造成健康且采食很好的犊牛猝死。还会出现其它神经症状，包括：肢体不协调，颤栗，躺倒回头或者痉挛。在更换日粮，外伤，管理调整，寄生虫或者其它不正常的情况时会创造出适宜梭菌生长的环境，梭菌会制造并分泌强效毒素。通常梭菌感染预后很差，往往发现时动物就已经死亡。由于治疗成功率很低，所以该病的重点在于预防，大范围的接种免疫能够有效的降低该疾病造成的损失，目前还有没有一次免疫就能预防上述四种梭菌病的疫苗相关研制报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种腐败梭菌、产气荚膜梭菌C型、产气荚膜梭菌D型、气肿疽梭菌四联灭活疫苗，用于预防牛、羊黑腿病(气肿疽)、恶性水肿(腐败梭菌)、肠毒血症(C、D型)。该疫苗主要成分有气肿疽梭菌和腐败梭菌的灭活菌液、C型产气荚膜梭菌类毒素和D型产气荚膜梭菌类毒素。本专利技术的技术方案1.一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成分有气肿疽梭菌和腐败梭菌的灭活菌液、C型产气荚膜梭菌类毒素和D型产气荚膜梭菌类毒素。2.如权利要求1所述的一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗，其特征在于所述四联灭活疫苗的制苗用生产菌株为腐败梭菌C55-1株、C型产气荚膜梭菌C59-2株、D型产气荚膜梭菌C60-2株和气肿疽梭菌C54-1株。3.如权利要求1或2所述的一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述疫苗制备方法为：(1)将所述气肿疽梭菌和腐败梭菌生产用菌株菌液接种适宜培养基进行培养，经过灭活和浓缩后收集浓缩菌液；将C型产气荚膜梭菌和D型产气荚膜梭菌生产用菌株菌液分别接种适宜培养基进行培养，经过灭活、脱毒、浓缩后收集制备的脱毒浓缩菌液；(2)将以上制备的四种浓缩菌液按比例混匀后加入佐剂混匀后得到反刍动物梭菌病四联灭活疫苗。本专利技术具体实施方式一、疫苗制备1.主要成分该疫苗主要成分有气肿疽梭菌和腐败梭菌的灭活菌液、C型产气荚膜梭菌类毒素和D型产气荚膜梭菌类毒素。2.菌种本专利技术涉及气肿疽梭菌C54-2株、腐败梭菌C55-1株、C型产气荚膜梭菌C59-2株和D型产气荚膜梭菌C60-2株(请参见请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p 40，52，48，50，)株均购自中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保藏管理中心。3.培养基腐败梭菌用胰酶消化牛肉汤，产气荚膜梭菌用肉肝胃酶消化汤或鱼肝肉胃酶消化汤，气肿疽梭菌用厌气肉肝汤，均购自荣成市雨林生物工程有限公司。4.制苗用菌液制备(1)制苗用菌液可以用玻璃瓶或培养罐进行静置培养；(2)培养工艺参数(见表1)表1培养工艺参数(3)毒素测定:1)腐败梭菌培养菌液的离心上清，静脉注射体重16～20g小白鼠0.005～0.01ml，应于48小时内死亡。2)产气荚膜梭菌C型的培养菌液离心上清，静脉注射体重16～20g小白鼠0.001ml，应于24小时内死亡。3)产气荚膜梭菌D型的培养菌液经胰酶活化后的菌液离心上清，静脉注射体重16～20g小白鼠0.00025～0.0001ml，0.001ml，应于24小时内死亡。(4)灭活或灭活脱毒按四种菌液培养量加入甲醛溶液，加入量为菌液培养量的0.4％～0.8％，灭活时间为气肿疽梭菌72～96小时，腐败梭菌72～144小时，产气荚膜梭菌120～192小时。每日充分振荡或搅拌。(5)灭活检验取样后接种厌气肉肝汤进行检验，应无菌生长。(6)脱毒检验用各菌液离心上清液静脉注射体重16～20g小白鼠各2～5只，每只0.5ml，观察24小时，小鼠存活为灭活脱毒合格。5.浓缩及配苗将灭活检验、脱毒检验合格的腐败梭菌、产气荚膜梭菌C型、产气荚膜梭菌D型和气肿疽梭菌菌液采用离心的方法分离菌体和类毒素菌液，分别收集四种菌液的菌体和类毒素菌液进行配苗并加入佐剂后混匀，得到液体疫苗。6.最小免疫剂量测定腐败梭菌、C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌最小免疫剂量测定：用制备的腐败梭菌、产气荚膜梭菌C型、产气荚膜梭菌D型菌液制成单苗。用体重1.5～2.0kg的家兔分成不同剂量组，每个剂量组5只，皮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成份有气肿疽梭菌和腐败梭菌的灭活菌液、C型产气荚膜梭菌类毒素和D型产气荚膜梭菌类毒素。

【技术特征摘要】
1.一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成份有气肿疽梭菌和腐败梭菌的灭活菌液、C型产气荚膜梭菌类毒素和D型产气荚膜梭菌类毒素。2.如权利要求1所述的一种反刍动物梭菌病四联灭活疫苗，其特征在于所述四联灭活疫苗的制苗用生产菌株为腐败梭菌C55-1株、C型产气荚膜梭菌C59-2株、D型产气荚膜梭菌C60-2株和气肿疽梭菌C54-1株。3.如权利要求1或2所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠洪涛，王蕾，吴昊，马宗耀，禚宝山，
申请(专利权)人：齐鲁动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37