本发明专利技术涉及一种肺炎球菌结合物组合，通过选择适合不同型别多糖的结合方法制备高免疫结合物，并将它们组成一个组合，成为高免疫原性的肺炎球菌结合物组合，用于预防肺炎球菌引起的感染性疾病。本发明专利技术所述组合疫苗由选自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F的肺炎球菌结合物组合制备而成。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术涉及一种肺炎球菌结合物组合，通过选择适合不同型别多糖的结合方法制备高免疫结合物，并将它们组成一个组合，成为高免疫原性的肺炎球菌结合物组合，用于预防肺炎球菌引起的感染性疾病。
技术介绍
：肺炎链球菌是导致发展中国家和发达国家各年龄组人群社区获得性肺炎(community acquire pneumonia，CAP)最重要的病原菌，同时也是引起中耳炎、肺炎、脑膜炎和菌血症的主要病原菌。在世界范围内，每年由于肺炎链球菌感染引起的死亡占总死亡人数的9％，每年由肺炎链球菌引起的脑膜炎3万多例，菌血症63万多例，中耳炎1400万例，肺炎2000万例。预防肺炎球菌感染的生物制品包括多糖疫苗和结合疫苗，其中多糖疫苗可用于2岁以上人群，主要适用人群是老年人以及一些免疫功能低下的特殊人群等，而结合疫苗可使用在婴幼儿及以上人群，免疫原性更好，可诱导免疫回忆反应，清除健康带菌等，比多糖疫苗具有明显的优势，是肺炎球菌疫苗研究的一个方向，目前已上市的肺炎球菌结合疫苗包括辉瑞公司的“13价肺炎球菌结合疫苗”和葛兰素史克公司的“10价肺炎球菌结合疫苗”，辉瑞公司原上市品种“7价肺炎球菌结合疫苗”已逐渐被13价疫苗所替代。结合疫苗主要的抗原成分是多糖蛋白结合物，多糖蛋白结合物的制备方法有多种，常用的方法包括：1.直接结合法：利用多糖结构上固有的反应基团直接或通过间隔剂与载体蛋白质相偶联。如宋内氏痢疾多糖结构中含有羧基基团，通过碳二亚胺(EDC)的介导，与己二酰二肼结合，再与载体蛋白质上的羧基反应，形成结合产物(Taylor DN，TrofaAC，Sadoff J，et al.Synthesis，characterization，and clinical evaluation of conjugate vaccine composed of O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1，shigella flexneri type 2a，and shigella sonnei(Plesiomonas shigelloides)bound to bacterial toxoids[J].Infect Immun 1993，61：3678-3687.)。碳二亚胺，结构如下全名为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，常用于羧基和伯胺的缩合。碳二亚胺可以与羧基形成可与氨基反应的O-酰基异脲(O-acylisourea)中间体，在有氨基存在的情况下，可发生缩合。但若反应体系中没有氨基，该中间体会很快水解恢复成羧基形式。若在反应体系中增加N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-hydroxysulfosuccinimide，Sulfo-NHS)，则可形成稳定的活泼脂中间体，可进一步和氨基缩合。碳二亚胺缩合反应路线如下。2.氰基活化法：通过氰根活化多糖链上的邻羟基，再与六碳间隔剂己二酰二肼(ADH)相连，衍生出多糖制备出衍生的多糖。衍生多糖和载体蛋白质在碳二亚胺的介导下，由碳二亚胺与载体蛋白质上的羧基形成O-酰基异脲中间体，再与衍生多糖上的胺基反应形成多糖蛋白质结合物。这种氰基活化方式采用的氰化物试剂通常为溴化氰(CNBr)、1-氰基-4-二甲基氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)等。采用的间隔剂包括丁二酸二酰肼(Butanedihydrazide)、己二酰二肼(ADH)等二肼类化合物，还包括二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷、二氨基己烷等二氨基烷类化合物，也包括己二酸二琥珀酰亚胺酯(DEA)等酯类化合物，还包括含反应官能团不一致的间隔剂，如氨基硫醇。Chiayung Chu等制备结合疫苗时，就采用溴化氰活化多糖，己二酰二肼衍生为间隔剂，通过EDAC介导缩合，制备出结合物(Chu Chiayung，R.Schneerson，JB Robbins，et al.Further Studies on the Immunogenicity of Haemophilus influenzae Type b and Pneumococcal Type 6A Polysaccharide Protein Conjugates[J].Infect Immun 1983，40：245-256.)。也有不采用间隔剂的，如Carine Capiau等以CDAP活化多糖后，直接与载体蛋白质的氨基反应，制备出肺炎和流脑结合疫苗(U.S.Pub.No.2003/0147922)，葛兰素史克上市的“10价肺炎球菌结合疫苗”就采用CDAP活化多糖，并直接与载体蛋白质的胺基反应制备结合物。3.胺还原法：多糖经氧化或水解后，可在末端生成醛基，醛基可与氨基反应形成希夫碱结构(Schiffs’base)，再经还原剂还原，可形成稳定的C-N结构，制备出结合物反应路线如下多糖氧化多采用高碘酸钠法，高碘酸是一种氧化剂。多糖含有丰富的二醇基(CHOH-CHOH)，被高碘酸氧化后，断裂形成二个末端醛基。高碘酸的特点是不再进一步氧化巳生成的醛基。如下面的C群流脑多糖高碘酸氧化反应氨还原法是医药领域应用最广的一种多糖蛋白质结合物制备方法。Jennings等采用氨还原法制备流脑结合疫苗(U.S.Pat.No.4,356,170)。Anderson也采用氨还原法制备b型流感嗜血杆菌小分子多糖与蛋白质的结合物(U.S.Pat.No.4,761,283)。辉瑞公司(Hausdorff等)上市的7价肺炎球菌结合疫苗和13价肺炎球菌结合疫苗也采用胺还原法(U.S.Pub.No.2007/0184071A1)。这些都是利用多糖氧化产生的醛基直接与蛋白质上的氨基反应，通过硼氰化钠的还原，制备结合物。也有学者利用氨还原法的原理，先将多糖产生的醛基与含氨基的间隔剂连接，再通过间隔剂与载体蛋白质相连接。Jessouroun等将蛋白质以肼基修饰，再与氧化后含醛基的多糖以氨还原法结合(U.S.Pub.No.2007/0110762A1)。Porro以氨还原法将氨基基团连接到还原寡糖上，再与载体蛋白质连接(U.S.Pat.No.5,306,492)。4.其它结合方法：包括肟化学反应、重氮化反应、二硫键连接反应等，但使用不是很广。N-琥珀酰亚胺-3-二硫代吡啶丙酸(SPDP)是常用的二硫键连接反应试剂，先将SPDP连接到含氨基的组分上，与含巯基的组分发生巯基交换反应，形成二硫键连接的结合物。Kossaczka等采用该方法制备了伤寒结合疫苗，但人体试验数据证明效果不理想(KossaczkaZuzana，FY Lin，VAHo，et al.Safety and Immunogenicity of Vi Conjugate Vaccines for Typhoid Fever in Adults，Teenagers，and 2-to 4-Year-Old Children in Vietnam[J].Infect Immun 1999，67：5806-5810.)。以下为SPDP介导的结合反应。肺炎球菌有90多个血清型，疫苗的开发多选择地区优势血清型，因此，疫苗都为多价次的，如已上市的10价、13价以及默克公司进入临床的15价。目前，各公司开发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，所述组合疫苗是由多种肺炎球菌结合物组合制备而成，所述肺炎球菌结合物为相应肺炎球菌血清型荚膜多糖与生理上可接受的载体蛋白质通过选择适合不同型别多糖的结合方法制备的高免疫多糖蛋白结合物，所述结合物的制备方法采用两种或两种以上结合方法，包括直接结合法、氰基活化法、胺还原法以及其他结合方法。
【技术特征摘要】
1.一种肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，所述组合疫苗是由多种肺炎球菌结合物组合制备而成，所述肺炎球菌结合物为相应肺炎球菌血清型荚膜多糖与生理上可接受的载体蛋白质通过选择适合不同型别多糖的结合方法制备的高免疫多糖蛋白结合物，所述结合物的制备方法采用两种或两种以上结合方法，包括直接结合法、氰基活化法、胺还原法以及其他结合方法。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述组合疫苗由选自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F的肺炎球菌结合物组合制备而成。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述组合疫苗由选自肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F、23F的肺炎球菌结合物组合制备而成。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中19A和19F采用CDAP介导的氰基活化法制备结合物，1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、23F采用胺还原法制备结合物。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：19A和19F采用CDAP介导的氰基活化法制备结合物，制备方法如下：溶解肺炎球菌多糖，经醋酸溶液水解后，调pH值至6.4，加入高碘酸钠氧化，甘油终止反应，透析或超滤去除小分子物质，获得氧化多糖。氧化多糖中加入ADH和硼氰化钠至终浓度40mg/ml和2mg/ml，室温反应3天，制备衍生物。衍生多糖和载体蛋白质按一定质量比混合，加入EDAC至终浓度0.02mol/L，维持pH值5.6反应150分钟以上，制备结合物。结合物经Sepharose 4FF层析纯化，收集V0附近洗脱峰，获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜琳，朱卫华，林彦彬，王瑞峰，胡小华，宗向坤，徐慧娴，胡月凤，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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