一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种鸭坦布苏病毒致弱毒株WR‑A83，其微生物保藏编号是CGMCC NO.10491。本发明专利技术筛选的鸭坦布苏病毒致弱毒株WR‑A83用于制备预防鸡、鸭和鹅坦布苏病毒的弱毒疫苗和灭活疫苗。弱毒疫苗株WR‑A83具有遗传性稳定、安全性好等重要生物活性，对鸡、鸭、鹅安全、无致病力，同时对鸡、鸭、鹅三种禽类的坦布苏病毒具有良好的免疫保护作用，由该致弱毒株制备的疫苗在有效剂量下保护率高，安全有效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种病毒的致弱及弱毒疫苗株，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株及其应用，属于兽医生物制品

技术介绍
鸭坦布苏病毒病是一种鸭坦布苏病毒(duckTembusuvirus,DTV)引起蛋鸭和种鸭产蛋量骤然下降，甚至绝产的烈性传染性疾病之一。患病的高产蛋率(如95％以上)蛋鸭和种鸭，发病后1周内从产蛋率迅速下降至10％以内，严重的于10天停产，这给我国养鸭业带来了灾难性的打击。预防坦布苏病毒的最有效的方法就是免疫接种。目前用于预防该病的疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗，众所周知，灭活疫苗相对于弱毒活疫苗存在不可避免的缺点：不产生局部免疫；引起细胞介导免疫的能力较弱；免疫力产生较慢，通常在接种2周后才能获得良好的免疫力。而活疫苗刺激机体产生抗体快，能激起全面的免疫应答。因此，使用灭活疫苗时往往需多次免疫以达到效果，而坦布苏病毒能引起蛋鸭(鸡和鹅)出现减蛋和产蛋异常，因此蛋鸭的免疫次数越少越好，以免因为接种疫苗产生应激而减蛋。所以，用于已开产的蛋鸭的疫苗，弱毒活疫苗相对于灭活疫苗更具优势。目前没有鸭商品化的弱毒疫苗，亦没有鸡和鹅的坦布苏病毒疫苗。若能生产一种既能免疫鸭又能免疫鸡和鹅坦布苏病毒的疫苗，则可节约生产成本，易于商品化，便于不同禽源的坦布苏病毒的预防。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种鸭坦布苏病毒致弱毒株WR-A83，及该致弱毒株在制备弱毒疫苗或灭活疫苗中的应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：将一株鸭坦布苏病毒WR株基因组测序和抗原性分析发现，与鸡源和鹅源坦布苏病毒基因组之间的核酸序列和氨基酸序列的同源性均很高，分别达98.4％和98.6％以上。该株鸭源坦布苏病毒与鸡源和鹅源坦布苏病毒不存在抗原性差异，为同一血清型坦布苏病毒。因此将WR株可作为制备鸡、鸭和鹅的坦布苏病毒疫苗的候选毒株。首先将WR株在鸭胚成纤维细胞上适应性传代，传代至细胞病变稳定时转为在传代细胞系(BHK-21)传至83代，其病毒效价TCID50基本稳定在10-8.5/0.1mL左右，即为本专利技术的弱毒疫苗株WR-A83作为种毒。取WR-A83作种毒，接种BHK-21传代细胞批量培养病毒，收获的病毒经无菌检验及外源病毒检测后，按1.5％比例加入明胶混匀且10倍稀释后无菌分装于无菌冻干瓶，每瓶2.5mL，-20℃冻存过后用真空冻干机冻干，制成弱毒疫苗，病毒效价应在107.5TCID50/0.1mL以上。测定该弱毒疫苗最佳免疫剂量及攻毒保护试验、安全性、保存期和稳定性。本专利技术的鸭坦布苏病毒致弱毒株WR-A83，由鸭坦布苏病毒强毒株WR株经细胞传代83代致弱后获得，该弱毒疫苗株具有遗传性稳定、安全性好等重要生物活性，对鸡、鸭、鹅安全、无致病力，同时对鸡、鸭、鹅三种禽类的坦布苏病毒具有良好的免疫保护作用。本专利技术的鸭坦布苏病毒致弱毒株WR-A83保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，微生物保藏编号是CGMCCNO.10491。本专利技术所述致弱毒株WR-A83可用在制备预防或治疗鸡、鸭和鹅坦布苏病毒药物中的应用。所述药物可制备成多种制剂，如片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液、注射剂等。本专利技术的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株WR-A83可作为鸡、鸭、鹅坦布苏病毒的活疫苗和灭活疫苗的应用。由本专利技术鸭坦布苏病毒致弱毒株WR-A83制备得到的弱毒疫苗，种毒病毒滴度更高，为10-8.5/0.1mL。投入生产中不需浓缩，且最佳的免疫剂量为病毒原液的10稀释度，这样大大节约了生产成本。本专利技术的弱毒疫苗株WR-A83在有效量下，可添加药学上可接受的载体和/或辅料制备预防鸡、鸭和鹅坦布苏病毒的疫苗组合物。所述药学上可接受的载体和/或辅料是指药学领域常规的药物载体和/或辅料，例如：稀释剂、赋形剂和水等；填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。本专利技术的弱毒疫苗株不仅能用于鸭坦布苏病毒的弱毒疫苗，还能同时应用于鸡和鹅的坦布苏病毒疫苗，即生产一种疫苗可以适应于三种禽类的坦布苏病毒的预防，这样减少了生成鸡源和鹅源的坦布苏病毒弱毒疫苗的生成工序。该疫苗的制备、生产、应用和普及将为我国坦布苏病毒病的有效防控提供有力保障。生物保藏说明：坦布苏病毒(Tembusuvirus)，于2015年4月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCCNo.10491。具体实施方式下面将结合本专利技术中的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：鸭坦布苏病毒致弱(1)鸭胚成纤维细胞上传代培养：取11日龄番鸭胚(无鸭坦布苏病毒母源抗体)消毒后，在生物安全柜内无菌的条件下进行如下操作：用高压灭菌的镊子取出胚体放于含PBS缓冲液的平皿内，洗涤两次后，剪掉鸭胚的头部、颈部、四肢及内脏，将剩余的胚体部分剪碎接着用0.25％V/V胰蛋白酶消化，再用移液管吹打细胞成单个的鸭胚成纤维细胞，用6％V/V小牛血清稀释成105/mL的细胞密度后，移至T25(5mL)细胞培养瓶内，于37℃，5％CO2细胞培养箱培养，次日用于接种鸭坦布苏病毒WR株。按1/10的培养基体积感染的病毒液，病毒的感染复数为1～5PFU/细胞，在病毒吸附细胞60分钟后，补加1％V/V小牛血清和抗生素(2000IU青霉素和2000μg/mL链霉素)的培养基维持液进行病毒增殖。当细胞病变达到80％时，将T25细胞培养瓶置于-80℃冰箱冻存，结冻后取出细胞瓶放室温解冻，冻融两次后，于生物安全柜里用移液管用力吹打细胞，将病毒悬液移至离心管，以10000rpm离心15分钟，收集离心后的上清液，即为病毒液。这样连续传代至第30代时，WR株在鸭胚成纤维细胞上的细胞病变时间稳定在第3d开始出现，且病毒滴度已达105TCID50/0.1mL。并以第30代病毒液作为毒种，转在传代细胞(BHK-21)进行培养。(2)WR株鸭坦布苏病毒在传代细胞上的培养①WR株鸭坦布苏病毒的细胞传代培养按5％的接种量接种75mL2单层BHK-21，感作1h，用无菌PBS清洗2次后，加入15mL含2％胎牛血清及1％双抗的高糖DMEM培养基于5％CO2，37℃温箱培养观察。待80％的细胞出现病变时，将细胞反复冻融3次，回收含毒细胞液，将一部分传代毒冻存，另一部分作为下一代的种毒，如此反复传代。按上述步骤在番鸭胚成纤维细胞连续传代到83，观察每一代细胞病变情况及病变时间。选取第20、30、40、50、60、70、75、78、80、83代细胞毒分别测定其TCID50和产生CPE的时间。测定结果表明，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭坦布苏病毒致弱毒株WR‑A83，其微生物保藏编号是CGMCC NO.10491。

【技术特征摘要】
1.一种鸭坦布苏病毒致弱毒株WR-A83，其微生物保藏编号是CGMCCNO.10491。2.如权利要求1所述致弱毒株WR-A83在制备预防或治疗鸡、鸭和鹅坦布苏病毒药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为弱毒疫苗或灭活疫苗。...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅秋玲，黄瑜，傅光华，陈红梅，程龙飞，施少华，万春和，林建生，刘荣昌，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35