本发明专利技术公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法，一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分：5×AMV缓冲液，无镁Taq酶10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶。本发明专利技术具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，可在3小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，也能检测GCRV感染的细胞，非常适用于GCRV的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于鱼类病毒检测
，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，还涉及一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法。
技术介绍
草鱼出血病是传染性、致病性都很强的一种严重病毒性疾病，主要危害草鱼鱼种。1972年首次在湖北滠口发现，并命名为草鱼出血病。1978年首次通过电镜观察证实该病原为病毒。1983年首次分离出爆发性草鱼出血病病原，并根据其形态学、理化特性等研究鉴定该病毒为呼肠孤病毒。1991年国际病毒分类委员会第五次会议将该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV),并纳入呼肠孤病毒科(Reoviridae)水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。草鱼呼肠孤病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒,现在已有资 料证实该病毒是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株，目前国内已报道了 20多个分离株。对草鱼呼肠孤病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方法，细胞培养分离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等经典方法较为复杂，目前国内外检测草鱼呼肠孤病毒最常用的还是免疫学检测方法及RT-PCR方法等。免疫学方法在敏感性和特异性上有待提高，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题。在现有的关于RT-PCR检测GCRV的公开文献中，都是采用传统的两步法RT-PCR技术，即将反转录和PCR反应分管分步进行。RT-PCR检测病原在近年来越来越趋向于采用一步法进行反应。与两步法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染的可能性，对反应的干扰因素少，能获得良好的重现性，又降低了成本，为开发同时检测多种病原的多重RT-PCR创造了有利条件。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，通过分析比对GenBank中已有的草鱼呼肠孤病毒基因序列(AF260512、AF284502、GQ896335、HQ231199、JN967630)，针对病毒核酸第2片段序列设计并筛选了一对兼并引物，从而实现一步法检测GCRV病毒的目的，所用的试剂均为国产试剂，大大降低了实验成本，从分子水平对草鱼呼肠孤病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，本方法可在3小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，也能检测GCRV感染的细胞(例如CIK细胞)，非常适用于GCRV的快速检测。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分该试剂盒包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶。GCRVF: 5，-GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3，；GCRVR: 5 ’ -ffDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3 ’。一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是I、病毒RNA的获取采用TRWix或TRW : LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。2、RT-PCR 扩增采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L, 5 X AMVbufferl μ L, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) O. 5-3 μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，补力口灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。3、检测结果判定取扩增产物，用I. 5% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法(最佳条件)，其步骤是I、病毒RNA的获取采用TRi/υΙκ或TRIzrf LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA，模板RNA在950C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。2、RT-PCR 扩增采用25 μ I反应体系在PCR管中加入预处理的核酸模板5 μ L，5 X AMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，补力口灭菌水至25 μ L。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35个循环，最后72°C延伸5min，4°C下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。3、检测结果判定取扩增产物，用I. 5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点I、本专利技术公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，能够检测出目前分离的所有的GCRV病毒株。2、特异性好，能有效检测出GCRV病毒；3、全部采用国产试剂，大大降低了检测成本；4、一步法提高了检测效率，缩短了检测时间。附图说明图I为一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的特异性的示意图从左至右的泳道依次为水的空白对照、GCRV-873、GCRV-HZ08株和104株感染CIK细胞的总RNA、SVCV感染EPC细胞的总RNA、CRV感染CCO细胞的总RNA、DLl, OOOMarker0图2为一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测草鱼组织的结果示意图从左至右的泳道依次为DL5，OOOMarker,8个疑似草鱼组织的总RNA、GCRV-104株感染CIK细胞的总RNA、水的空白对照。具体实施例方式下列实例进一步说明本专利技术，但不应该当做对本专利技术的限制。本专利技术 全部试剂均为上海生工公司产品。实施例I :一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分该试剂盒它包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶。实施例2 草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒所用缓冲液的优化一、取待检样品提取病毒RNA:培养草鱼肾脏细胞(CIK细胞)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为O. I的剂量，接种ImL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的草鱼呼肠孤病毒细胞毒材料GCRV-104(CCTC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种草鱼呼肠孤病毒？RT？PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：？5×AMV？缓冲液，无镁Taq酶10×PCR？缓冲液，MgCl2？，dNTPs？，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶；GCRVF:？5’？GGBTCCACDGYMACVTCCAC？3’；GCRVR:？5’？WDRTCRCCKKGRGGCATGTA？3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张辉，曾令兵，周勇，范玉顶，徐进，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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