检测禽呼肠孤病毒的通用PCR引物及其检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测禽呼肠孤病毒的通用PCR引物及其检测试剂盒，该PCR引物包括上游引物5’‑ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC‑3’和下游引物5’‑ACAGAATGGAGACRGAAT‑3’，该检测试剂盒包含了上述PCR引物。该检测试剂盒操作简便，通用性好，特异性强，灵敏度高，成本低，可以同时进行大批量样本分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对禽呼肠孤病毒进行快速检测的通用PCR引物、通用RT-PCR方法及其检测试剂盒。
技术介绍
禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)是双链RNA病毒，属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，正呼肠孤病毒属(Orthoreivirus)。呼肠孤病毒可引起鸡的多种疾病，包括病毒性关节炎、矮小综合征、呼吸道疾病、肠道疾病和所谓吸收不良综合征，既可通过水平传播使鸡感染，亦可通过种蛋垂直传播，给养殖业造成巨大经济损失。ARV为无囊膜，呈20面体对称的双衣壳结构，基因组为线性双股RNA，由分节段的10个基因片段组成，根据核酸电泳迁移率可分成3组，即大基因节段(L)、中基因节段(M)的和小基因节段(S)。S基因组分S1、S2、S3和S4基因段，其中S1基因全长1643bp，其编码的σC蛋白是外壳蛋白中最小的一个结构蛋白，携带有特异性中和反应的表面抗原，能诱导产生型特异性中和抗体，增强蛋白合成，促进病毒增长，对ARV的感染及其致病性起关键作用。ARV各毒株之间虽然有共同的群特异性抗原，但各毒株的致病性却存在很大差异，既存在高致病性的毒株，同时也存在无致病性毒株。通常高致病性毒株多引起病毒性关节炎和生长受阻，而无致病性的毒株与这些症状无相关性。ARV诊断有传统的病毒分离方法(鸡胚接种、细胞培养)和血清学方法(琼扩试验、免疫荧光抗体技术、ELISA等)。病毒分离鉴定准确可靠，可作为确诊依据，但耗时较长，操作复杂；血清学方法并不能作为确诊的依据，主要用于鸡群抗体和感染情况的监测。生物技术的飞速发展极大地推动了生命科学各个领域的发展，疾病的诊断、病原的检测已从细胞水平进入分子水平。ARV分子结构与致病性关系研究的日益深入为ARV的特异性诊断技术研究奠定了基础。根据不同致病性毒株存在的分子结构差异，相继建立了特异、快速的分子诊断技术，包括核酸探针技术和基因片段的体外扩增技术等。这些技术不仅应用于ARV的检测、鉴定和特性研究及致病性的检测，还可以追踪病毒的来源及流行情况。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方面有着广阔的应用前景，现已被广泛应用。反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)能够选择性地将病毒基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感性。1997年，谢芝勋建立了检测ARV的RT-PCR方法，2001年建立了更敏感的半套式PCR，可检测到1fg的RNA；2002年，廖敏建立了一步法RT-PCR检测ARV，缩短了检测的时间，最低可检测出0.16ng的ARV RNA。大量研究结果证明，利用特异性引物对ARV进行RT-PCR扩增不失为一种快速、准确的检测方法。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测禽呼肠孤病毒的通用PCR引物，以及使用了该引物的PCR扩增反应体系、RT-PCR检测方法和检测试剂盒，该PCR扩增反应体系、RT-PCR检测方法和检测试剂盒操作简便，通用性好，特异性强，灵敏度高，成本低，可以同时进行大批量样本分析。为实现上述目的，本专利技术提供了一对检测禽呼肠孤病毒的PCR引物，包括上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’(如序列表SEQ ID No.1所示)和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’(如序列表SEQ ID No.2所示)。其中上游引物和下游引物中的R为简并引物，R＝A/G。本专利技术还提供了一种包含上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’的检测试剂盒。本专利技术还提供了一种检测禽呼肠孤病毒的PCR扩增的反应体系，包括以下组分：其中：上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’。20μM的上下游引物是指引物自身的浓度，而非其在PCR扩增的反应体系中的终浓度。在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述反应体系进行PCR扩增的反应程序为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃45s，51.3℃45s，72℃45s；最后经过72℃10min延伸。在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，所述样本取自待测菌悬液或家禽临床病料，如：鸡、鸭、鹅的临床病料。在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，当样本取自家禽临床病料时，样本总RNA提取前还包括样本预处理的步骤，所述样本预处理的方式为：取脏器组织样本、泄殖腔拭子样本或口咽拭子样本，将样本在灭菌生理盐水中研磨均匀并混悬，离心取上清。在上述反应体系另外一种可能的实现方式中，总RNA进行反转录的方式为：加入总RNA 4μl和随机引物1μl轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min，然后依次加入下列成分：5×反应缓冲液4μl，dNTP混合物2μl，核酸酶抑制剂1μl，反转录酶0.5μl和DEPC处理水7.5μl，之后轻轻混匀，在37℃作用1h，得到样本cDNA。本专利技术还提供了一种检测禽呼肠孤病毒的RT-PCR方法，包括如下步骤：1)样本总RNA的提取；2)对步骤1)的总RNA进行反转录，得到样本cDNA；3)利用上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’，对步骤2)所得cDNA进行PCR扩增；4)分析步骤3)所得PCR产物，如果扩增产物包含710bp的片段，则样本为禽呼肠孤病毒检测阳性，否则为检测阴性。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带，目的条带即为710bp。以NCBI数据库中ARV-SD09-1株(GenBank登录号为KP288853)S1片段全基因序列作为参考，设计和筛选新型引物，上游引物在S1基因的209nt-228nt之间，下游引物在901nt-918nt之间。以该新型引物扩增ARV S1基因中保守区序列长度约710bp的核苷酸序列，整体思路为：提取样本总RNA并进行反转录(RT)合成cDNA后，利用上述引物进行聚合酶链式反应(PCR)，采用下列反应程序：预变性94℃5min，30个循环(94℃45s，51.3℃45s，72℃45s)，最后经过72℃10min延伸，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，利用紫外凝胶成像仪检测目的条带，如果扩增出目的条带则证明为ARV检测阳性，否则为检测阴性。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1)扩增的目的片段位于ARV的S1蛋白的高度保守区，且核苷酸序列为710bp，因而敏感性好、操作方便，对不同地区ARV分离株均有较好检出、通用性好且片段大小适中，非常适合用于检测组织；2)该方法对其它常见禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽腺病毒、禽传染性喉气管炎病毒和滑液囊支原体的检测结果皆为阴性，没有交叉反应，表明该方法亦具有良好的特异性；3)本专利技术方法适用于养禽生产中进行ARV的检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对检测禽呼肠孤病毒的PCR引物，其特征在于，包括上游引物5’‑ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC‑3’和下游引物5’‑ACAGAATGGAGACRGAAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一对检测禽呼肠孤病毒的PCR引物，其特征在于，包括上游引物5’-ACTGTTGTAAGGCTAAGRTC-3’和下游引物5’-ACAGAATGGAGACRGAAT-3’。2.一种包含权利要求1所述PCR引物的检测试剂盒。3.一种PCR扩增的反应体系，其特征在于，包括以下组分：4.一种检测禽呼肠孤病毒的RT-PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：1)样本总RNA的提取；2)对步骤1)的总RNA进行反转录，得到样本cDNA；3)利用权利要求1所述PCR引物，对步骤2)所得cDNA进行PCR扩增；4)分析步骤3)所得PCR产物，如果扩增产物包含710bp的片段，则样本为禽呼肠孤病毒检测阳性，否则为检测阴性。5.根据权利要求4所述RT-PCR方法，其特征在于，cDNA进行PCR扩增的反应体系为：6.根据权利要求3所述的反应体系或权利要求5所述的RT-PCR方法，其特征在于，所述反应体系进行PCR扩增的反应程序为：预变性94℃5min；30个循环，每个循环为94℃45s，51.3℃45s，72℃45...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国中，徐美玉，冯金玲，任颖超，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11