在固相载体扩增核酸的方法技术

本发明专利技术提供了使用一固相载体从一核酸的混合物中扩增一核酸的方法。所提供的方法使用用户定义的引物寡核苷酸来进行定向扩增。同时所提供的方法还使用封闭子和取代子寡核苷酸来产生长度限定的扩增的目标核酸。一样本被施用于所述固相载体，所述样本中的所述目标核酸与一固定于一固相载体的第一寡核苷酸结合。含有一目标结合区域和一聚合酶启动子序列的一引物序列退火与所述被结合的目标核酸结合，延伸产生一第一双重核酸。所述目标序列移除后，留下与一固定于一固相载体的第二寡核苷酸结合的一第一核酸。所述第二寡核苷酸延伸以产生一含有一第二核酸的第二双重核酸，所述第二核酸通过添加一聚合酶扩增。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】在固相载体扩増核酸的方法相关申请的交叉引用本申请是申请日为2013年3月14日、申请号为61/781，356的临时专利申请的非临时专利申请。关于联邦研究或发展资助的申明无以光盘形式提交的相关参考资料无
技术介绍
(I)专利
本专利技术与纯化、固定和扩增核酸的方法有关，尤其是，使用一固相载体扩增核酸。(2)相应技术描述对于本领域技术人员而言，已知有许多纯化和扩增核酸的方法。然而，这些方法缓慢、冗长、昂贵并且难以实行自动化和生产化。并且它们在灵敏性、特异性、准确性、精确性，和否则能使它们成功应用于许多不同的应用所需的特质中表现欠佳。这些方法通常复杂，需要将目标核酸从样本中分离出来，准备扩增的目标，实行扩增并检测扩增的产物。在一些应用中，还可能包括为测序如下一代测序准备模板，和对目标核苷酸进行测序。在很多方法中，还需要一或多步纯化的步骤。所有这些步骤增加了操作的时间、花费、复杂度和劳动量。提供具备诸如特异性、灵敏性、选择性、准确性和精确性等多种优势的方法十分重要。这些方法快速、高效、易于使用，实验步骤和用于容易地从一个原始样本中获得一期望的分离和扩增的产物的试剂的用量都是最少的。这些产物可能为可作为用于立即测序或下一代测序的模板的扩增的核酸或者一组扩增的核酸(即多重反应，包括高度的多重反应)，溶解于溶液中或在固相载体上。此外，保持链方向的定向扩增方法在测绘和更精确的定量测量中(如基因表达水平)提供了合适的序列排列。另外，这些方法能够与本领域已知的广泛的核酸扩增方法一起使用。此外这些方法也能够与标签序列合用。本专利技术提供了从样本中纯化、固定和扩增特异的核酸的方法，克服了本领域技术中现有的很多不足之处。专利技术概要本专利技术提供了在固相载体上固定和扩增核酸的方法。更具体地，是一种从含有核酸混合物的样本中固定和扩增期望的一核酸或一些核酸(多重反应)的方法。本专利技术的一方面是，所述方法提供与一固相载体或可选择地与分别的固相载体相连的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。所述第一寡核苷酸被封闭以防止3’端的延伸，并且具有与一目标核酸的一第一部分相互补的序列。所述第二寡核苷酸具有一与所述目标核苷酸的一第二部分相同的序列。一样本被施用于所述固相载体，并且所述样本中的目标序列与所述第一寡核苷酸结合。然后洗涤所述固相载体以去除未结合的核酸以及所述样本中的其他组分。包括一目标结合区域和一含有聚合酶启动子序列的标签区域的一引物退火后与结合的目标核苷酸结合。通过聚合酶引物延伸产生一第一双重核酸。所述目标序列从所述第一双重核酸移除，产生一未被结合的第一核酸。所述第一核酸退火与所述第二寡核苷酸结合，并且所述第二寡核苷酸通过聚合酶延伸，产生一包括一第一核酸和一第二核酸的一第二双重核酸。通过向所述固相载体加入特异于启动子序列的聚合酶产生了一多拷贝的第三核酸的，以此来扩增所述目标核酸。在第二实施方案中，所述引物可与所述样本和固相载体相连，从而所述引物与所述目标杂交，同时所述目标与所述第一寡核苷酸杂交。然后洗涤所述固相载体以去除未被结合的核酸和引物以及所述样本中的其他组分。在第三实施方案中，所述方法还包括可以额外扩增所述期望的目标核酸的步骤。在这些步骤中，所述多拷贝的第三核酸与所述第二寡核苷酸在所述固相载体上结合。所述第二寡核苷酸通过聚合酶延伸产生一第三双重核酸。所述第三核酸从所述第三双重核酸上分离产生一与所述固相载体相结合的一第四核酸。所述引物序列退火后与所述第四核酸结合，并且所述引物和所述第四核酸均通过聚合酶延伸产生包括一第五核酸和额外的第二核酸的一第四双重核酸。所述第四双重核酸与一特异于在所述第四双重核酸上的一启动子的聚合酶孵育，产生额外的多拷贝的所述第三核酸。根据该实施方案，所述第三核酸可被进一步扩增。在第四实施方案中，所述引物包括一含有一个或多个非天然核苷酸，如异胞嘧啶(isoC)和/或异鸟嘌呤(isoG)的标签序列以提高与所述目标核酸结合的特异性并减少其余核酸的扩增。在第五实施方案中，四个不同的第二寡核苷酸可与所述固相载体相连，四个不同的第二寡核苷酸各含有一位于3’末端的不同的核苷酸以及与在一特定的单核苷酸多态性(SNP)位点上的所述第一核酸相连的序列。在此形态下，扩增可被应用于在单个实验中鉴定所有四个可能的SNP。在第二方面，为后续操作提供了一片段核酸目标的方向性扩增，如测序。在一实施方案中，一样本与一第一引物施用于一固相载体。所述第一引物含有在3’端含有约3至9个核苷酸的随机序列以及在5’端的一第一标签序列，用以决定所述片段化的核酸目标的方向。提供了与固相载体结合的第一和第二寡核苷酸，其可与相同的固相载体结合或，可选择地，与不同的固相载体固定。所述第一寡核苷酸任选地被封闭以阻止可能的核酸外切酶酶切，如在5’端的酶切，并且含有一与所述片段化的核酸目标的一部分互补的序列。可选择地，所述第一寡核苷酸含有一序列(譬如，一随机或半随机序列)使得所述片段化的核酸目标的一些片段得到固定。所述第二寡核苷酸序列与所述第一引物的所述标签序列中至少一部分互补。所述第一引物退火后与所述片段化的核酸目标结合，所述结合的片段化的核酸目标退火后与所述第一寡核苷酸结合。洗涤所述固相载体以清除未被结合的样本和第一引物。所述第一引物序列通过聚合酶延伸以产生含有所述片段化的核酸目标和一第一核酸的一第一双重核酸。所述片段化的核酸目标从所述第一双重核酸移除以产生一第一核酸。所述第一核酸退火后与所述第二寡核苷酸结合，并且一第二引物添加至所述固相载体。所述第二引物含有一 3’末端为大约6?9个核苷酸、5’末端有一第二标签序列的随机序列，其可含或不含与所述第一引物中的所述第一标签序列中发现的原件相同或相似的原件。所述第二引物退火后与所述第一核酸结合，通过聚合酶延伸以产生一含有所述第一核酸和一第二核酸的第二双重核酸，所述第二核酸在3’末端含有一第一标签序列且在5’末端含有一第二标签序列。所述第二核酸进一步扩增以产生一目标核酸，其含有决定所述核酸目标方向的标签序列。在这方面的一个实施方案中，所述第一引物可进一步含有一条形码序列作为标签序列的一部分进一步辅助鉴定和定向。在第三方面，提供了一方法，其中所述第一引物含有与所述目标核酸互补的序列，并且固定在一固相载体上。在一实施方案中，取代子和封闭子寡核苷酸被应用。所述取代子寡核苷酸与所述核酸目标在所述目标序列的一位点上杂交，所述位点位于一条或多条结合在同一核酸目标上的寡核苷酸的3’端。当所述取代子通过聚合酶延伸，所述增长的延伸产物与所述另外结合的一条或多条寡核苷酸相遇，并将其连同任何由所述结合的一条或多条寡核苷酸所启始的延伸产物一起取代。在这一实施方案中，所述取代子寡核苷酸有一与所述目标核酸的第二部分互补的序列，所述第二部分在所述第一位置的3’端处。所述封闭子有一与所述目标核酸的第三部分互补的序列，所述第三部分在所述第一部分的5’端处。这些寡核苷酸和所述目标核酸被应用于所述固相载体。所述取代子和封闭子寡核苷酸退火后与所述目标核酸结合，通过与所述第一引物的杂交，所述退火的目标被固定于所述固相载体上。所述固相载体被洗涤以除去未结合的核酸和所述样本的其他成分。所述第一引物通过聚合酶延伸。延伸在所述封闭子寡核苷酸处终止，以产生一长度限定的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一从一含有一核酸混合物的样本中固定和扩增一目标核酸的方法，所述方法包括步骤：施用所述样本于一固相载体，所述固相载体含有与其粘附的一第一寡核苷酸与一第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸被封闭以防止从3’末端的延伸，并具有与所述目标核酸的一第一部分互补的序列，所述第二寡核苷酸具有一与所述目标核酸的一第二部分相同的序列，其中所述目标核酸与所述第一寡核苷酸结合，任选地洗涤所述固相载体以移除未结合的核酸；一引物与所述目标核酸杂交，其中所述引物含有一目标结合区域和一聚合酶启动子序列，通过聚合酶延伸所述引物以产生一第一双重核酸，任选地从所述双重核酸移除所述目标核酸以产生一第一核酸；所述第一核酸退火与所述第二寡核苷酸结合，通过聚合酶延伸所述第二寡核苷酸以产生一含有所述第一核酸和一第二核酸的第二双重核酸；和，通过聚合酶产生多重拷贝的一第三核酸，从而扩增所述目标核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：莱尔·J·阿诺德，诺曼·C·纳尔逊，
申请(专利权)人：莱尔·J·阿诺德，诺曼·C·纳尔逊，
类型：发明
国别省市：美国;US