本发明专利技术涉及一种烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，具体涉及烟草FT(Flowering?locus?T)基因NtFT1及其在诱导烟草早花中的应用，属于分子生物学中的基因领域。本发明专利技术公开了源自烟草的控制植物开花时间的NtFT1基因全长编码序列及其编码的蛋白序列。NtFT1基因是通过同源序列搜索，从中国烟草基因组测序计划数据中经Blastn比对及剪切位点分析得到的。以此序列涉及出一对NtFT1基因特异引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了该基因。本发明专利技术还构建了NtFT1基因的PVX病毒表达载体，构建的病毒表达载体经农杆菌渗滤侵染烤烟品种红花大金元、云烟87和K326，能诱导这些品种早花，证明该基因具有诱导烤烟早花的功能。将NtFT1基因的PVX病毒瞬时表达系统用于烟草育种，可缩短烟草生育期、加快育成烟草新品种的年限。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，具体涉及烟草FT (Flowering locus T)基因NtFTl及其在诱导烟草早花中的应用，属于分子生物学中的基因领域。
技术介绍
植物开花是一个非常复杂的过程，受到外部环境因素和内部基因表达的影响调控。对拟南芥开花分子机理的研究表明，拟南芥的开花受四条途径控制，即光周期、自主途径、春化途径和赤霉素途径，光周期途径信号经CO (CONSTANCE)传递给FT(Flowering LocusT)，春化途径和自主途径信号经FLC (Flowering Locus C)传递给FT，FT基因的表达诱导诱导花分生组织特异基因APl的表达，从而诱导开花。FT基因是控制植物开花信号的汇集点，所以FT基因在诱导植物早花的基因工程研究中应用也最为广泛、最为有效。FT基因编码的蛋白质属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)家族。不同作物的FT基因高度保守，这为分离克隆FT基因提供了方便。转基因研究表明，过量表达FT基因能够诱导拟南芥早花。另外从水稻、番茄、杨树、柑橘等中克隆的FT基因的同源基因Hd3a、SFT、PtFTl和CiFT等也都能够诱导植物早花。利用植物病毒载体表达外源基因是新近发展起来的一种基因瞬时表达方法。与转基因方法相比，该方法操作简单，可在短期内使外源基因迅速表达，而且能同时对多个品种进行感染。马铃薯X病毒(Potato Virus X，PVX)作为外源基因的病毒表达载体被广泛应用。其载体构建策略是将外源基因插入重复的CP (Coat Protein)启动子之间，利用CP基因的启动子来指导外源基因 的表达。烟草是我国主要经济作物之一。普通栽培烟草是短日照作物。我国烟草育种工作虽然取得了明显的成绩，但目前生产上的主栽品种比较单一。急需加大烟草品种选育工作的进度。烟草生育期比较长，是限制烟草育种进程的一个主要因素。拟南芥FT基因能够有效缩短烟草开花时间，而且北卡州立大学烟草育种组已经将该技术成功应用于烟草育种。但是，由于FT基因受国际专利保护，限制了我国烟草育种家对该基因的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，将源自烟草的控制植物开花时间的NtFTl基因全长编码序列及其编码的蛋白序列。NtFTl基因是通过同源序列搜索，从中国烟草基因组测序计划数据中经Blastn比对及剪切位点分析得到的。以此序列涉及出一对NtFTl基因特异引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了该基因。本专利技术另一个目的在于还构建了 NtFTl基因的PVX病毒表达载体,构建的病毒表达载体经农杆菌渗滤侵染烤烟品种红花大金元、云烟87和K326，能诱导这些品种早花，证明该基因具有诱导烤烟早花的功能。将NtFTl基因的PVX病毒瞬时表达系统用于烟草育种，可缩短烟草生育期、加快育成烟草新品种的年限。本专利技术是这样完成的本专利技术提供一个首次从烟草中获得植物开花时间调节基因的全长cDNA，命名为NtFTl，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1ο本专利技术提供一对从烟草中克隆烟草NtFTl的PCR引物。引物序列为正向引物NtFT1-F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC，反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。本专利技术提供一种从烟草中克隆烟草NtFTl基因的方法。具体而言，首先利用拟南芥FT基因序列作为搜索序列，在Genbank烟草GSS数据库中用tblastx程序进行比对，获得一致性最高的烟草基因组序列(FH969747.1)，利用该序列搜索中国烟草基因组计划测序数据库，将该序列向两侧延伸得到IOOOObp左右的基因组序列信息。通过剪切位点分析，获得候选烟草FT基因的cDNA序列，如序列SEQ ID NO:1所示。根据候选序列设计PCR引物NtFTl-F和NtFTl-R。取黑烟草Narrow leaf madole即将开花烟株的叶片，利用Trizon(Invitrogen)试剂提取 RNA,用 SuperScript RT Kit (Invitrogen)合成 cDNA 第一链,然后用NtFTl-F和NtFTl-R进行RT-PCR (图1)，PCR产物测序结果与候选序列100%—致。扩增所述基因的全长或基因中任一片段的引物对属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了 NtFTl基因编码的多肽序列，其特征在于具有如SEQ ID N0:2所示的177个氨基酸序列。本专利技术的另一目的是这样完成的构建烟草NtFTl基因的病毒瞬时表达载体具体过程如下，将已构建的拟南芥FT基因的PVX表达载体pCAM pGR106-FT的FT基因用Cla I和Sal I切下，回收大片段`质粒片段。由于NtFTl基因里有Sal I酶切位点，所以在扩增NtFTl cDNA片段的正反引物上分别引物Cla I和Xho I (F: ATCGATATGCCAAGAGAACGTGAACC，下划线所示为 Cla I 酶切位点；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC,下划线所示为Xho I酶切位点)，Xho I是Sal I的同尾酶。PCR产物经测序验证后与上述回收的载体片段连接，获得NtFTl PVX瞬时表达载体pCAM pGR106_NtFTl。构建好的载体进行酶切验证(图2)。本专利技术还提供了 NtFTl基因在调节烟草开花中的应用。将上述PVX病毒表达载体pCAM pGR106-NtFT转化农杆菌菌株GV3101，经农杆菌渗滤后，使NtFTl在受体烟株中瞬时表达，促使烟草在渗滤后40 50天开花。构建的重组载体(pCAM pGR106_NtFTl)能够诱导烟草早花，应用于烟草育种，可以缩短烟草开花时间，达到缩短育种年限的目的，这方面的应用同时受本专利技术的保护。除上述构建的PVX病毒载体外，利用所述基因构建的其他瞬时表达载体、转基因植物表达载体或利用所述基因任何部分片段构建的RNA干涉载体，都在本专利技术的保护范围之内。本专利技术还保护利用所述基因及任何部分片段进行的转基因研究。附图说明图1为NtFTl基因全长cDNA片段的RT-PCR扩增电泳图谱。图2为NtFTl基因PVX瞬时表达载体的酶切验证电泳图谱。其中pCAM pGR106-NtFT酶切验证，用Cla I和Sal I酶切得到389bp片段。图3来源于不同植物的FT基因的多序列比对。图4 A为烟草FT基因NtFTl基因的PVX系统能够诱导烤烟红花大金元。图4 B为烟草FT基因NtFTl基因的PVX系统能够诱导烤烟云烟87。图4 C为烟草FT基因NtFTl基因的PVX系统能够诱导烤烟K326早花。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。任何在本专利技术基本精神上地改进或替代，仍属于本专利技术权利要求书所要求保护地范围。下述实施例中地实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用到地试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。NtFTl基因cDNA序列信息的获得首先利用拟南芥FT基因氨基酸序列(AEE34381.1)作为搜索序列，在Genbank烟草GSS数据库中用tblastn程序进行比对，获得一致性最高的烟草基因组序列(FH96本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种烟草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在于从烟草中获得植物开花时间调节基因的全长cDNA，命名为NtFT1，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1。
【技术特征摘要】
1.一种烟草NtFTl基因的CDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在于从烟草中获得植物开花时间调节基因的全长cDNA，命名为NtFTl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。2.根据权利要求1所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在于所述的NtFTl基因编码的多肽序列，具有如SEQ ID NO:2所示的177个氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在从烟草中克隆烟草NtFTl的PCR引物，引物序列为正向引物NtFTl-F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC ；反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。4.根据权利要求1或2所述的烟草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬时表达诱导烟草早花，其特征在从烟草中克隆烟草NtFTl基因的具体方法如下，首先利用拟南芥FT基因序列作为搜索序列，在Genbank烟草GSS数据库中用tblastx程序进行比对，获得一致性最高的烟草基因组序列(FH969747.1),利用该序列搜索中国烟草基因组计划测序数据库，将该序列向两侧延伸得到IOOOObp左右的基因组序列 目息；通过剪切位点分析，获得候选烟草FT基因的cDNA序列，如序列SEQ ID NO:1 ；根据候选序列设计PCR引物NtFTl-F和NtFTl-R,取黑烟草Narrow leaf madole即将开花烟株的叶片，利用Trizon (Invitrogen)试剂提取RNA,用SuperScript...
【专利技术属性】
技术研发人员：高玉龙，谢贺，肖炳光，李永平，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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