重组系统技术方案

本发明专利技术涉及在靶位点进行重组的方法，该方法包括：提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；(c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列；和(d)编码标记的序列，其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记的序列；以及使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能标记的连续核酸序列和编码重组酶的序列，所述编码标记和/或重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组系统专利
本专利技术涉及在靶位点进行重组的方法。所述方法还涉及根据在体内进行的本专利技术方法制备的细胞。专利技术背景不同的细胞类型可以用于不同的工业目的。例如哺乳动物细胞系用于抗体生产；真菌细胞是生产多肽和次级代谢物的优选生物；细菌细胞优选用于小的代谢物和抗体的生产；植物细胞优选用于口味和风味化合物。重组技术广泛用于这样的细胞和/或使用这样的细胞的方法的生产力的最优化。这可涉及大量的选择，包括但是不限于过表达感兴趣的基因，竞争途径的缺失或失活，改变酶的区室化(compartmentalization)，增加蛋白或代谢物分泌，增加细胞器含量(organellecontent)等。就丝状真菌而言，可获得的可选择标记有限使新细胞系的构建复杂化。典型地，靶序列在体外被改变以产生带有插入的抗生素抗性标记的突变等位基因。然而，鉴于大规模使用携带抗性基因的生产菌株将这种基因扩散到生物圈的潜在风险，大多数国家的监管机构反对使用抗生素抗性标记。此外，适用于丝状真菌的可选择标记数量有限。因此，可需要除去可选择标记基因以使生产菌株可以在商业上使用和/或以使同样的标记基因可以在连续的菌株修饰中再循环利用。专利技术概述本专利技术涉及在例如靶基因组内在靶位点(targetlocus)或多个靶位点(targetloci)进行重组的方法。本专利技术所述的重组方法导致靶位点的改变，例如在靶位点插入核酸序列。可实施所述的方法以使在靶位点插入新的序列并伴随从靶位点除去现存的序列。也就是说，所述方法可被用于将靶位点上的序列替换为替代性序列。所述方法可方便地在宿主细胞体内实施。典型地，当在体内实施时，不对人类或动物细胞实施本专利技术所述的方法。也就是说，典型地不以治疗方法的形式实施本专利技术所述的方法。可以离体或体外方式实施本专利技术所述的方法。术语离体或体外应被理解为包括对微生物(对完整活细胞或非细胞物质二者)实施的方法，但排除对人类或动物实施的方法。典型地，实施所述方法使至少部分插入在靶位点的序列随后被移除。如果实施所述的方法以在靶位点替换序列并随后移除插入的序列，那么结果可以是使靶位点的序列缺失。因此，可实施本专利技术所述的方法以改变靶位点的序列。这种改变可以是，例如添加新的序列、置换现存的序列和/或缺失/去除现存的序列。典型地，本专利技术在宿主细胞体内进行。宿主细胞可以优选地是生产感兴趣的化合物的细胞。宿主细胞可以在应用本专利技术方法之前能够生产感兴趣的化合物。在这种情况下，本专利技术的方法可以用于修饰靶位点以使通过宿主细胞的感兴趣的化合物的生产改变，例如可以增加产量。或者，宿主细胞可以是由于应用本专利技术的方法而生产感兴趣的化合物的细胞。因此根据本专利技术，提供了在靶位点进行重组的方法，该方法包括：-提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；(c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列；和(d)编码标记的序列，其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记基因的序列；以及-使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能标记和/或必需基因(essentialgene)的连续核酸序列以及编码重组酶的序列，所述编码标记和/或编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。因此，所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记基因的序列，各包含重组后编码有功能标记的部分序列(并且其中所述部分自身不编码有功能的标记)。本专利技术还涉及通过在体内实施的根据本专利技术所述的方法所产生的细胞。与现有方法相比，本专利技术方法的优势在于其允许在菌株转化中连续使用非反向选择标记(non-counterselectablemarker)。这是有利的，特别是在丝状真菌中，其中已知的反向选择标记数量有限且再循环标记用于重复使用极其重要。此外，这种系统允许使用单一多核苷酸中不包含完全敲除盒的载体。这避免了克隆问题，以及更稳定的核苷酸片段(在酵母或E.coli中位点特异性重组酶不能作用于其重组位点，例如因为它们并不都存在)。而且，使用可以通过利用自动方法扩增产生的核酸片段实施本专利技术的方法。这导致了更高通量的更为灵活的系统，因为片段扩增(例如通过PCR)比限制性消化更容易自动化。利用本专利技术的方法可以得到极其高效的菌株构建(接近100％效率)，且所述方法可被用于比使用现有技术更快地产生多重敲除，因为可以在一个步骤中引入和/或除去多个标记。使用本专利技术的方法可以更易于表征地追踪菌株构建和修饰，因为位点特异性重组位点可以保留在靶位点(targetlocus)或多个靶位点(targetloci)。附图简述图1展示了质粒pDELNicB-3的示意图，其是用于使A.niger中的nicB基因失活的置换盒的基础。置换盒包含nicB的侧翼区域、hygB标记盒、突变loxP位点和E.coliDNA。在实施例部分(参见下文)可以找到关于pDELNicB-3的更多细节。图2展示了质粒pDEL_PdxA-2的示意图，其是用于使A.niger中的pdxA基因失活的置换盒的基础。置换盒包含pdxA的侧翼区域、ble标记盒、突变loxP位点和E.coliDNA。在实施例部分(参见下文)可以找到关于pDEL_PdxA-2的更多细节。图3展示了质粒pDEL_EPO_Hyg-1的示意图，其包含使A.niger中的epo基因失活的置换盒的一部分。置换盒包含epo的侧翼区域、hygB标记盒的一部分、突变loxP位点和E.coliDNA。在实施例部分(参见下文)可以找到关于pDEL_EPO_Hyg-1的更多细节。图4展示了质粒pDEL_EPO_CRE-1的示意图，其包含使A.niger.中的epo基因失活的置换盒的一部分。置换盒包含epo的侧翼区域、hygB标记盒的一部分、突变loxP位点、cre重组酶表达盒和E.coliDNA。在实施例部分(参见下文)可以找到关于pDEL_EPO_CRE-1的更多细节。图5展示了片段产生以及A.niger中的转化和重组中这些片段的使用的示意图。顶部展示了利用PCR扩增产生“二重左”(“bipartiteleft“)和“二重右”(“bipartiteright“)片段。底部图中展示了通过二重左片段和二重右片段在基因组内的同源重组转化A.niger。图6展示了片段产生以及A.niger中的转化和重组中这些片段的使用的示意图(同样展示于图5)。这个特定实施例中的各二重(bipartit)片段不同，因为它们另外包含Cre重组酶盒。最后的图展示了Cre诱导的重组事件之后产生的基因组位点的布局。图7展示了Cre诱导的侧翼为loxP的hygB选择标记的丢失。上部板是Cre未诱导的转化体。下部板是通过涂布在作为碳源的木糖上而使Cre被诱导。百分比展示了Cre诱导后，A.niger菌落中标记移除的百分比。图8描述了用于在真菌中瞬时表达cre重组酶的pEBA513的图谱。pEBA513是pAMPF21衍生的载体，其包含AMA1区域和CAT氯霉素抗性基因。显示的是cre重组酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
在靶位点实施重组的方法，其中所述方法包括：‑提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；(c)编码识别所述位点特异性重组位点的重组酶的序列；和(d)编码标记的序列，其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组以产生单一核酸，和其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记的序列；和‑使所述两种或更多种核酸相互重组和与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能标记的连续核酸序列和编码重组酶的序列，所述编码标记和/或编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点，以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.12 EP 12159098.81.在靶位点实施重组以使所述靶位点的现存序列缺失的方法，其中所述方法包括：-提供两种或更多种核酸，它们合在一起成为组时总共包含：(a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；(c)编码识别所述位点特异性重组位点的重组酶的序列；和(d)编码标记的序列，其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组以产生单一核酸，和其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记的序列；和-使所述两种或更多种核酸相互重组和与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能标记的连续核酸序列、编码重组酶的序列和至少两个位点特异性重组位点，所述编码标记和/或编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点，以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列，其中在真菌细胞体内实施所述核酸的相互重组和与靶位点的侧翼序列的重组，所述方法还包括：-表达所述重组酶以使位于所述位点特异性重组位点之间的序列被外重组，其中在体内实施所述位点特异性重组位点之间的核酸序列的外重组，其中：所述位点特异性重组位点是lox位点，以及所述重组酶是Cre；所述位点特异性重组位点是FRT位点，以及所述重组酶是Flp；所述重组位点是Vlox位点，以及所述重组酶是VCre；或者所述重组位点是Slox，以及所述重组酶是SCre。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述两种或更多种核酸总共包含能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列，以使所述两种或更多种核酸相互重组和与靶位点的侧翼序列重组导致在每个靶位点插入至少两个位点特异性重组位点，其中所述两种或更多种核酸的重组导致：每个靶位点都存在编码有功能标记的连续序列；至少一个靶位点存在编码有功能重组酶的序列；所述编码标记和/或编码重组酶的序列位于至少两个位点特异性重组位点之间；和所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：诺尔·尼克拉斯·玛利亚·伊丽莎白·佩吉·范，马帝那·贝舒森，伊万内·约翰内斯·奥迪利亚·亚伦德森，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL