本发明专利技术提供全悬浮培养型Marc‑145细胞系的驯化方法，步骤如下：（1）贴壁培养型Marc‑145细胞的培养；（2）低血清贴壁培养型Marc‑145细胞系的驯化；（3）低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化；（4）无血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化。应用本发明专利技术的细胞驯化方法能够得到悬浮培养的Marc‑145细胞，该细胞适应低血清和无血清全悬浮培养，在7.5L的反应器按无血清培养密度可达8×106/ml，至少可得到4.4×1010的细胞，相当于80‑90个15L滚瓶或18‑20个40层细胞工厂收获的细胞数量，发明专利技术效果明显。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法。
技术介绍
Marc-145细胞是1993年Kim HS等从恒河猴胚肾细胞MA-104中克隆得到的上皮细胞，该细胞可连续传代呈贴壁型生长，是目前研究和生产猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV，俗称“蓝耳病”)及疫苗最理想的细胞株，还可用于鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)和猪细小病毒(Porcine parvovirus virus，PPV)等病毒的体外增殖。因Marc-145为贴壁型生长，在病毒培养和疫苗生产时该细胞均采用贴壁单层培养，细胞的量受制于容器(如：细胞工厂、滚瓶)或介质(如：微载体)的表面积，大规模生产时需要足够大的厂房或价格昂贵的微载体以及大量的人工操作，而且生物反应器微载体培养目前在放大培养时仍存在许多技术难题没有解决，推广应用仍有难度。现阶段工业化单层培养Marc-145细胞时，培养基中均加一定比例的牛血清(包括胎牛血清或新生牛血清)细胞才能正常生长，牛血清不仅价格贵，而且牛血清来源于自然生物体，牛源本身携带和采集加工过程有污染外源微生物和致病因子的可能，使用会存在生物安全风险。另外，牛血清是一种天然混合物，其具体成份目前还没有完全分析清楚，生物制品生产中使用后对下游纯化工艺造成困难，如果有残留通常会引起接种者的副反应而影响产品质量。生物制品生产中细胞培养如能采用无血清全悬浮工艺，培养规模就容易线性放大，避免了细胞贴壁培养和使用牛血清带来的工艺缺陷，可提高病毒产量和产品质量，但是驯化无血清全悬浮培养型细胞株是目前最关键的技术瓶颈之一。本专利技术提供一种低血清和无血清高密度全悬浮培养型Marc-145细胞及其制备方法和应用方法，为用全悬浮培养Marc-145细胞生产PRRSV疫苗提供细胞基质及制备方法和培养方法。
技术实现思路
本专利技术提供了全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法，并提供了驯化后的全悬浮培养型Marc-145细胞的扩大培养方法。本专利技术提供全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法，步骤如下：(1)贴壁培养型Marc-145细胞的培养 选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc-145细胞，待细胞生长致密单层后用含10％新生牛血清的DMEM培养液按1：4比例分瓶传代，置37℃5％CO2的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；(2)低血清贴壁培养型Marc-145细胞系的驯化 a)将步骤(1)所述生长正常的贴壁培养型Marc-145细胞分别用含新生牛血清8％、5％的DMEM培养液各培养三代。每次传代的标准是按1∶4比例分瓶，在37℃5％CO2培养，在48-72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成DMEM/F12后加5％新生牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中新生牛血清降为3％，按b步骤中的方法，传代比例降为1∶3再培养三代；d)培养液中新生牛血清降为1％，在培养液中再加体积百分含量20％上一代次培养了该细胞48-72h的培养液继续培养五代，传代标准同步骤c)；细胞在48h-72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型Marc-145细胞系；(3)低血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化 a)将步骤(2)驯化的低血清贴壁培养型Marc-145细胞，用DMEM/F12和无血清培养基1号按体积比1∶1比例混合后，加3-5％新生牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至3-5×105/ml，100-130r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×106/ml时，800-1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×106/ml时，800-1000r/min离心按1∶2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×106/ml时，800-1000r/min离心按1∶3比例分瓶培养；在连续三代按1∶3比例培养48h细胞密度均达2×106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型Marc-145细胞系；(4)无血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化 a)在无血清培养基2号(兰州百灵生物技术有限公司，货号：BFLM101.05)中加3％新生牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型Marc-145细胞直接稀释到密度5-7×105/ml，置100-130r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×105/ml接种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1％，到第4代时血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×106/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型Marc-145细胞系。本专利技术还提供应用权利要求1所述的方法得到的全悬浮培养型Marc-145细胞。本专利技术还提供全悬浮培养型Marc-145细胞在无血清培养基中的培养方法，步骤如下：a)种子细胞培养，复苏一支全悬浮培养型Marc-145细胞，用40-60ml无血清培养基2号加5-10％新生牛血清，置110r/min、37℃5％CO2培养；当细胞生长至3×106/ml以上时，用无血清培养基2号加1-3％新生牛血清的培养液将细胞稀释至密度为5-7×105/ml，计250-350ml，100r/min、37℃5％CO2培养；扩大培养至细胞密度达3×106/ml以上时，再用无血清培养基2号直接将细胞稀释至密度为5-7×105/ml继续扩大培养，总体积为400-600ml；培养条件为：100-130r/min、37℃5％CO2；细胞密度达3×106/ml以上时，转入生物反应器培养；b)生物反应器批培养：用无血清培养基2号接种密度为5-7×105/ml的全悬浮培养型Marc-145细胞至生物反应器培养体积，培养条件为：转速70-120r/min、温度37℃、溶氧40-70％、pH7.15-7.25。本专利技术还提供全悬浮培养型Marc-145细胞在无血清培养基中的培养方法，步骤如下：用无血清培养基2号接种全悬浮培养型Marc-145细胞至生物反应器培养，起始细胞密度为5-7×105/ml，起始培养体积比生物反应器培养允许最小体积多10-20％，培养条件为：转速50-70r/min、温度37℃、溶氧25-40％、pH7.15-7.25；细胞密度达2×106/ml以上时补加与起始培养体积相等的无血清培养基2号，培养条件改为：转速70-90r/min、温度37℃、溶氧35-45％、pH7.15-7.25；细胞密度达4×106/ml以上时补加无血清培养基2号至最高培养体积，培养条件改为：转速90-120r/min、温度37℃、溶氧50-70％、pH7.10-7.20。本专利技术还提供全悬浮培养型Marc-145细胞在低血清培养基中的培养方法，步骤如下：用无血清培养基2号加1-3％新生牛血清接种全悬浮培养型Marc-145细胞至生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
全悬浮培养型Marc‑145细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：（1）贴壁培养型Marc‑145细胞的培养选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc‑145细胞，待细胞生长致密单层后用含10%新生牛血清的DMEM培养液按1：4比例分瓶传代，置37℃ 5% CO2的培养箱培养，在48‑72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；（2）低血清贴壁培养型Marc‑145细胞系的驯化a)将步骤（1）所述生长正常的贴壁培养型Marc‑145细胞分别用含新生牛血清8%、5%的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5%CO2培养，在48‑72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成DMEM/F12后加5%新生牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中新生牛血清降为3%，按b步骤中的方法，传代比例降为 1：3再培养三代；d）培养液中新生牛血清降为1%，在培养液中再加体积百分含量20%上一代次培养了该细胞48‑72h的培养液继续培养五代，传代标准同步骤c)；细胞在48h‑72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型Marc‑145细胞系；（3）低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化a)将步骤（2）驯化的低血清贴壁培养型Marc‑145细胞，用DMEM/F12和无血清培养基1号按体积比1：1比例混合后，加3‑5%新生牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至3‑5×105/ml，100‑130r/min、37℃ 5% CO2摇床培养；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×106/ml时，800‑1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×106/ml时，800‑1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×106/ml时，800‑1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞系；（4）无血清全悬浮培养型Marc‑145细胞的驯化a) 在无血清培养基2号中加3%新生牛血清，将步骤（3）中得到的低血清全悬浮培养型Marc‑145细胞直接稀释到密度5‑7×105/ml，置100‑130r/min、37℃5%CO2摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×105/ml接种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1%，到第4代时血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×106/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型Marc‑145细胞系。...
【技术特征摘要】
1.全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：（1）贴壁培养型Marc-145细胞的培养选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，对PRRSV敏感的贴壁培养型Marc-145细胞，待细胞生长致密单层后用含10%新生牛血清的DMEM培养液按1：4比例分瓶传代，置37℃ 5% CO2的培养箱培养，在48-72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；（2）低血清贴壁培养型Marc-145细胞系的驯化a)将步骤（1）所述生长正常的贴壁培养型Marc-145细胞分别用含新生牛血清8%、5%的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5%CO2培养，在48-72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成DMEM/F12后加5%新生牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中新生牛血清降为3%，按b步骤中的方法，传代比例降为 1：3再培养三代；d）培养液中新生牛血清降为1%，在培养液中再加体积百分含量20%上一代次培养了该细胞48-72h的培养液继续培养五代，传代标准同步骤c)；细胞在48h-72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型Marc-145细胞系；（3）低血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化a)将步骤（2）驯化的低血清贴壁培养型Marc-145细胞，用DMEM/F12和无血清培养基1号按体积比1：1比例混合后，加3-5%新生牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至3-5×105/ml，100-130r/min、37℃ 5% CO2摇床培养；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×106/ml时，800-1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×106/ml时，800-1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×106/ml时，800-1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型Marc-145细胞系；（4）无血清全悬浮培养型Marc-145细胞的驯化a) 在无血清培养基2号中加3%新生牛血清，将步骤（3）中得到的低血清全悬浮培养型Marc-145细胞直接稀释到密度5-7×105/ml，置100-130r/min、37℃5%CO2摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×105/ml接种培养，每培养一代新生牛血清浓度下降1%，到第4代时血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×106/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型Marc-145细胞系。2.应用权利要求1所述的方法得到的全悬浮培养型Marc-1...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔自林，马忠仁，徐水林，王家敏，令世鑫，冯玉萍，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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