表达猪pCD163的细胞系、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种表达猪pCD163的细胞系，通过RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163，将真核表达质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。所述的细胞系在临床分离PRRSV病毒和生产PRRSV疫苗中的应用。本发明专利技术构建的pCD163-MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了PRRSV增殖率低的局限性；对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。

【技术实现步骤摘要】
表达猪pCD163的细胞系、其制备方法及应用
本专利技术涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种表达猪pCD163的细胞系，还涉及此细胞系的制备方法及应用。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS），俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。现阶段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。PRRSV表现出相当严格的细胞嗜性，PRRSV在感染猪体时，其主要的靶细胞为肺泡巨噬细胞（PAM），在体外培养时，则只能在CL2621、MARC-145等细胞中增殖。PAM非常容易感染PRRSV，但是PAM难于获得且只能原代培养，操作成本高昂，无法在PRRSV的疫苗生产中使用；MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV，但是存在着增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的局限性。CD163是PRRSV细胞受体，可以单独介导PRRSV的吸附和内吞。研究发现，将CD163分子导入PRRSV非易感细胞，使该细胞表达CD163蛋白后就能够感染并增殖PRRSV，成为PRRSV易感细胞。CD163在MARC-145细胞中的表达量很低，导致了MARC-145细胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低。公开号为CN103525773A的中国专利技术专利申请，公开了一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用。通过构建能够表达猪蓝耳病病毒受体硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重链ⅡA受体中的单个或多个的Marc145细胞或MA-104细胞，再利用该细胞接种猪蓝耳病病毒，收集病毒液，猪蓝耳病病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可进一步用于蓝耳病疫苗生产。说明书中具体实施方式详细公开了细胞系的构建方法及病毒培养效价，构建过程中使用的载体为pIRES2-EGFP。利用能表达猪蓝耳病病毒受体细胞接种病毒，可连续收获病毒且收获病毒滴度提高2～5倍，而所制备疫苗的效力并没有降低，在不增加额外生产成本的基础上，使单位时间产能提高2～5倍。本专利技术人认为，上述效果还有进一步提升的空间。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中pCD163在MARC-145细胞中的表达量低，导致了MARC-145细胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的问题，本专利技术提供了一种可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV的表达猪pCD163的细胞系pCD163-MARC。本专利技术还提供了所述细胞系pCD163-MARC的制备方法。本专利技术还提供了所述细胞系pCD163-MARC的应用。本专利技术是通过以下步骤得到的：一种表达猪pCD163的细胞系，通过以下步骤得到的：通过RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163，将真核表达质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。根据GenBank公布的pCD163的基因序列（GenBankNo:HM991330）设计一对扩增pCD163受体基因序列的引物，序列如下：pCD163-Fwd(XhoI):5’-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，pCD163-Rev(NotI):5’-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。所述的细胞系，优选RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，PCR反应体系为25µL，含cDNA1µL，Mg2+1.5mmoL/L，dNTP200µmoL/L，10×LAPCRBuffer2.5µL，pCD163-Fwd(XhoI)和pCD163-Rev(NotI)各400nmoL/L，TaKaRaLATaq2U；反应条件为：预变性95°C5min；然后进行35个循环，循环条件为95°C45s，61°C45s，72°C1min；然后72°C延伸10min。所述的细胞系在临床分离PRRSV和生产PRRSV疫苗中的应用。所述的应用，优选将含有PRRSV的病料样品接种至所述的细胞系，盲传5代，出现明显CPE的为分离到病毒。所述的应用，优选将所述的细胞系感染PRRS疫苗株，培养若干小时后收毒，用于疫苗的生产。采集健康猪肺脏分离PAM（猪肺泡巨噬细胞），提取RNA，通过RT-PCR扩增获得pCD163基因。然后将该基因插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163。将该质粒转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选。采用有限稀释法获得单克隆细胞并扩大培养，IFA、Westernblot鉴定获得的细胞系，通过pCD163-MARC与CN103525773A中的细胞系对PRRSV增殖的差异比较试验，证实pCD163-MARC细胞系增殖PRRSV的优势。本专利技术所构建的pCD163-MARC细胞系比CN103525773A中公开的Marc-145/CD163细胞（以下简称对照细胞）对PRRSV增殖的滴度提高了100.6-0.7TCID50，更适合于临床PRRSV的分离和疫苗生产。本专利技术的有益效果是：（1）本专利技术构建的pCD163-MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了以往MARC-145细胞系PRRSV增殖率低的局限性；（2）通过病毒增殖实验证明，在相同的条件下，本专利技术构建的pCD163-MARC细胞系对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。附图说明：图1为从PAM细胞中扩增出的pCD163基因电泳图，其中1和2均为pCD163RT-PCR产物，M为DL15,000DNAMarker，图2为本专利技术重组真核表达质粒pCI-pCD163XhoI/NotI双酶切鉴定图谱，其中1和3代表两个不同重组阳性质粒XhoI/NotI双酶切结果；2和4代表两个不同重组阳性质粒对照；M为DL15,000DNAMarker，图3为间接免疫荧光（IFA）检测两种细胞中CD163蛋白的表达情况，其中左图为MARC-145细胞，右图为本专利技术构建的pCD163-MARC细胞系，图4为Westernblot检测两种细胞中CDl63蛋白的表达情况，其中1为MARC-145细胞中CD163蛋白的表达情况，2为本专利技术构建的pCD163-MARC细胞系中CD163蛋白的表达情况，下部分为β-actin内参，图5为PRRSV经典株SD-1株(A)和高致病性毒株SD-JN株(B)感本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达猪pCD163的细胞系，其特征是通过以下步骤得到的：通过RT‑PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI‑neo中，构建真核表达质粒pCI‑pCD163，将真核表达质粒pCI‑pCD163转染MARC‑145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。

【技术特征摘要】
1.一种表达猪pCD163的细胞系，其特征是通过以下步骤得到的：通过RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163，将真核表达质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得;RT-PCR扩增获得pCD163受体基因中使用的引物序列如下：pCD163-Fwd:5’-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，pCD163-Rev:5’-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。2.根据权利要求1所述的细...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜以军，王金宝，丛晓燕，陈蕾，齐静，孙文博，吴家强，陈智，于江，郭立辉，任素芳，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37