甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化。利用本发明专利技术的方法可以快速从甘蔗胚性愈伤组织培养获得悬浮细胞系，并通过酶消解后分离纯化获得质量高、数量足、均一性好的完整原生质体，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供理想的实验材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物原生质体的分离与纯化方法，具体涉及一种，属生物

技术介绍
植物原生质体克服了细胞壁这一屏障，是植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等理论研究的理想材料，而且在基因工程及作物改良新品种培育方面有着重要应用前景。近年来，随着植物分子生物学发展，原生质体作为一个单细胞系统广泛地应用在基因定位、基因表达调控、RNA沉默机理、细胞钙信号转导及其调节机制等方面的研究。甘蔗愈伤组织原生质体的研究始于上世纪70年代，原生质体分离、培养和植株再生也获得成功。但是，与模式植物烟草或拟南芥叶肉细胞原生质体研究相比，甘蔗愈伤组织·原生质体分离纯化效果不尽理想，植株再生频率很低，直至今日没有长足发展。以甘蔗愈伤组织原生质体为受体材料，开展甘蔗转基因瞬时表达未见报道。本专利技术建立高效、快速的甘蔗愈伤组织原生质体的分离和纯化方法，获得高质量、高产量的原生质体可作为外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究的受体材料。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、高效、简便的，克服现有甘蔗愈伤组织原生质体分离和纯化方法存在质量和数量上的不足的问题，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供高质量、高产量的甘蔗愈伤组织原生质体。本专利技术的目的是通过以下方法实现的。本专利技术的，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化；其特征在于操作步骤如下 1、甘蔗愈伤组织培养 取消毒后的甘蔗心叶组织，无菌条件下切成1-2 Cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28°C暗培养1-2个月，每隔2周继代I次；所述MS3固体培养基为MS+0. 5 g/L水解酪蛋白+3mg/L 2, 4-D+30 g/L 鹿糖 +6. O g/L 琼脂粉；MS 培养基为 1962 年,Murashige 和 Skoog 公开的MS培养基(下同)； 2、甘蔗悬浮细胞培养 将甘蔗胚性愈伤组织捣碎后，在MS3液体培养基中，28 V暗培养2周，纱布过滤，滤液静置10-15 min,吸取底部胚性愈伤组织培养液，于恒温摇床震荡培养，转速120转/秒，28°C暗培养1-2月，每隔I周继代I次，直至悬浮细胞系出现；所述MS3液体培养基:MS+0. 5g/L水解酪蛋白+3 mg/L 2, 4-D+30 g/L蔗糖，去离子水补足I升； 3、甘蔗原生质体的分离取步骤2的新鲜悬浮细胞分装到50 mL离心管，100 g离心2 min ;弃上清液，用酶解缓冲液清洗悬浮细胞后，100 g离心2 min ;弃上清液，取悬浮细胞2-3克加入6孔的细胞培养板内，用3 mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体；所述酶解缓冲液0. 02mol/L MES+0. 4 mo I/L甘露醇+0. 02 mo I/L氯化钾，pH 5. 7 ;所述酶解反应液2 %纤维素酶+0.1 %果胶酶+0.01 mol/L氯化钙+0. I %牛血清蛋白，溶解于酶解缓冲液；在酶解反应液中，各原料所占的百分比为各原料与酶解缓冲液的重量百分比； 4、甘蔗原生质体的纯化 用无菌水清洗70 ym孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，取步骤3获得的原生质体转移至10 mL离心管中，100 g离心2 min ;弃上清液，冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100 g离心I min ;弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体，在电子显微镜下观察，形态正常的原生质体量达IO6个/mL ;所述W5溶液2 mmol/L MES+154 mmol/L氯化纳+125 mmol/L氯化韩+5 mmol/L氯化钾，pH 5. I0本专利技术还保护利用上述方法分离与纯化的甘蔗愈伤组织原生质体在甘蔗转基因 瞬时表达中的应用。本专利技术使用的所有化学试剂为分析纯。本专利技术的优点是，快速从甘蔗胚性愈伤组织培养获得悬浮细胞系，并通过酶消解后分离纯化获得质量高、数量足、均一性好的完整原生质体，为甘蔗外源基因表达、启动子分析、基因沉默等转基因瞬时表达研究提供理想的实验材料。附图说明图I是分离纯化后的甘蔗原生质体，标尺为0. 2 μ m。图2是pUbi-EYFP-Nos和pUbi-P19_Nos (P19是番茄丛矮病毒编码的RNA沉默抑制子)质粒转化后，EYFP基因在原生质体上的瞬时表达，标尺为0. 2 _。图3是pUbi-EYFP-Nos和pUbi- Y b-Nos ( Y b是大麦条纹花叶病毒编码的RNA沉默抑制子)质粒转化后，EYFP基因在原生质体上的瞬时表达，标尺为0. 2 mm。图4是pUbi-EYFP-Nos和pUbi_Nos (不含任何沉默抑制子的空载体)质粒转化后，EYFP基因在原生质体上的瞬时表达，标尺为0. 2 mm。图5是不同启动子质粒转化原生质体后GUS的瞬时表达活性，其中，A为pPr4-GUS-Nos,B 为 pUbi-GUS-Nos，C 为 p35S-GUS_Nos，D 为 pUbi-Nos (空载体)质粒；左侧的标尺表示⑶S活性值,单位为pmol 4-MU/ μ g protein · min,图中误差线为标准误。具体实施例方式为了进一步阐明本专利技术而不是限制本专利技术，以下结合实施例加以说明。实施例I :一种，包括以下步骤 1、甘蔗愈伤组织培养选取生长正常且无病虫害的甘蔗梢部，去除外围的老叶直至最高可见肥厚带叶和顶部长出的多余叶片，保留25 Cm长的心叶组织；用体积比为75 %的酒精溶液进行表面擦洗消毒后，在无菌超净工作台里，将甘蔗心叶组织切成I. 5 cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28 °C暗培养I. 5个月，每隔2周继代I次； 2、甘蔗悬浮细胞培养挑选致密、金黄色、颗粒状的胚性愈伤组织5克，捣碎后，移入100 mL MS3液体培养基，28°C暗培养2周后，将胚性愈伤组织培养液纱布过滤，滤液静置12min，用移液管吸取底部10 mL细小胚性愈伤组织培养液，用100 mL MS3液体培养基在恒温摇床里震荡培养，转速120转/秒，28°C暗培养1-2月，每隔I周继代I次，直至细小、均一的悬浮细胞系出现。3、取步骤2的新鲜悬浮细胞分装到50 mL离心管，或者将步骤2的悬浮细胞继代培养3天后，分装到50 mL离心管；100 g离心2 min ;弃上清液，加入40 mL酶解缓冲液清洗悬浮细胞，100 g离心2 min ;弃上清液，取悬浮细胞2-3克加入6孔的细胞培养板内，用3 mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体； 4、用无菌水清洗70 μ m孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，将步骤3酶解过夜的甘蔗悬浮细胞通过尼龙网过滤，取5 mL滤液转移至10 mL离心管中，100 g离心2 min ;弃上清液，I mL冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100 g离心I min ;弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体。·取I mL冰浴的W5溶液再次悬浮原生质体；用血球计数板在100倍显微镜下计算原生质体数量，完整的原生质体如图I所示，低温贮藏备用。实施例2 :利用从甘蔗品种CP72-1210心叶愈伤组织分离、纯化的原生质体，研究不同植物病毒编码的沉默抑制子的活性。I、PEG遗传转化 1.1将制备好的甘蔗CP72-1210愈伤组织原生质体冰浴30 mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甘蔗愈伤组织原生质体的分离与纯化方法，包括甘蔗愈伤组织培养、甘蔗悬浮细胞培养、甘蔗原生质体的分离和甘蔗原生质体的纯化；其特征在于操作步骤如下：(1)？甘蔗愈伤组织培养取消毒后的甘蔗心叶组织，无菌条件下切成1？2？cm厚的薄片，在MS3固体培养基上，28？℃暗培养1？2个月，每隔2周继代1次；所述MS3固体培养基为：MS+0.5？g/L水解酪蛋白+3？mg/L？2,4？D+30？g/L蔗糖+6.0？g/L琼脂粉；MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；(2)？甘蔗悬浮细胞培养将甘蔗胚性愈伤组织捣碎后，在MS3液体培养基中，28℃暗培养2周，纱布过滤，滤液静置10？15？min，吸取底部胚性愈伤组织培养液，于恒温摇床震荡培养，转速120转/秒，28？℃暗培养1？2月，每隔1周继代1次，直至悬浮细胞系出现；所述MS3液体培养基：MS+0.5？g/L水解酪蛋白+3？mg/L？2,4？D+30？g/L蔗糖，去离子水补足1升；？？？？(3)？甘蔗原生质体的分离？？？？取步骤（2）的新鲜悬浮细胞分装到50？mL离心管，100？g离心2？min；弃上清液，用酶解缓冲液清洗悬浮细胞后，100？g离心2？min；弃上清液，取悬浮细胞2？3？g加入6孔的细胞培养板内，用3？mL酶解反应液酶解过夜，分离出甘蔗愈伤组织原生质体；所述酶解缓冲液：0.02？mol/L？MES+0.4？mol/L甘露醇+0.02？mol/L氯化钾，pH？5.7；所述酶解反应液：2？%纤维素酶+0.1？%果胶酶+0.01？mol/L氯化钙+0.1？%牛血清蛋白，溶解于酶解缓冲液；在酶解反应液中，各原料所占的百分比为各原料与酶解缓冲液的重量百分比；？？？？(4)？甘蔗原生质体的纯化？？？？用无菌水清洗70μm孔径的尼龙网，然后用W5溶液润洗，取步骤（3）获得的原生质体转移至10？mL离心管中，100？g离心2？min；弃上清液，冰浴的W5溶液悬浮原生质体，100？g离心1？min；弃上清液后即为纯化的甘蔗愈伤组织原生质体；所述W5溶液：2？mmol/L？MES+154？mmol/L？氯化纳+125？mmol/L？氯化钙+5？mmol/L？氯化钾，pH？5.7。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高三基，米尔科夫艾瑞克，朴钟元，陈如凯，傅华英，付为林，林艺华，吴小斌，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：