一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法技术

本发明专利技术公开了一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法。本发明专利技术所提供的用RNA病毒转化植物原生质体的方法是将从感染RNA病毒的植物中提取的总RNA转入到植物原生质体中；所述RNA病毒为多分体RNA病毒，如甜菜坏死黄脉病毒；所述植物原生质体为烟草原生质体，如本生烟原生质体。本发明专利技术以本生烟烟草叶片为制备原生质体的材料，经聚二乙醇介导将感染了甜菜坏死黄脉病毒病叶的植物总RNA接种到本生烟原生质体内，成功建立甜菜坏死黄脉病毒对原生质体的侵染。本发明专利技术为研究甜菜坏死黄脉病毒与本生烟寄主间的致病机制提供了一个理想模型，对揭示该病毒与寄主植物间互作及病毒演化具有重要的理论价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法。
技术介绍
甜菜丛根病是危害甜菜的重要病害，目前已成为世界各甜菜产区的一种毁灭性病害，尤其对甜菜产量和含糖量影响极大。近年来该病害在内蒙古、甘肃、新疆和黑龙江等主要甜菜产区都有不同程度的发生，严重影响我国甜菜制糖业的发展。该病害的病原物是甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus, BNYVV),该病毒是Benyvirus 属的代表病毒，由甜菜多粘菌(Polymyxa beta)传播(Tamada, T and Baba, T.Beet necrotic yellow vein virus from rhizomania-affected sugar beet in Japan.Ann PhytopatholSoc Japan. 1973，39:325-332)。BNYVV 是正义 RNA 多分体病毒，其基因组由4飞条RNA组成，分别包装在不同长度的杆状病毒粒子中。其中RNAl和RNA2编码“持家基因”，是病毒侵染各种寄主所必需的，而RNA3和RNA4不是病毒所必需的(Bouzoubaa，S.,Niesbach-Klosgen, U. , Jupin,1. , Guilley, H. , Richards, K. , and Jonard, G. Shotrenedforms of Beet necrotic yellow vein virus RNA-3and_4:1nternal deletions and asubgenomic RNA. Journal of General Virology,1991，72:259-226)。BNYVV 仅 RNAl 和RNA2就可以系统侵染本生烟，其中RNA2编码的P14是其系统运动所必需的，其他小组分RNAs的系统运动能力和致病性各有不同。分子实验证实含有RNA4的BNYVV田间分离物接种本生烟时可产生严重症状，即新生叶下卷，植株矮化(Rahim M.D.，Andika1. B. , Han C. GH. , and Tamada T. RNA4-encoded p31ofBeet necrotic yellow vein virus is involvedin efficient vector transmission, symptom severity and silencing suppressionin root. Journal of General Virology, 2007，88:1611-1619)。野生型 RNA3 在本生烟的选择压下更快地产生内部缺失型RNA3，并且缺失型的RNA3与本生烟的严重症状相关，而RNA5 则极易在系统叶上发生自 我丢失(Wang Ying, Fan Huiyan, Wang Xian-Bing, Li Min,Han Chenggui, Li Dawei, Yu Jialin. Detection and characterization of spontaneousinternal deletion mutants of Beet Necrotic yellow vein virus RNA3from systemichost Nicotianabenthamiana. Virology Journal, 2011，8:355)。之前由于接种体系的限制，BNYVV的相关研究都主要集中在田间寄主甜菜或其他一些枯斑寄主(昆诺藜或者番杏)上进行，而其与病毒系统侵染模式植物本生烟的研究还有待进一步深入。原生质体是去除细胞壁，由质膜包裹的裸露细胞。由于原生质体失去了细胞壁这一屏障，不仅使其成为植物学、细胞生物学、生物工程和作物改良的理想材料，也成为植物病毒研究的有效手段。烟草原生质体是植物病毒研究中应用最早、最广泛的植物材料，它在植物病毒的侵染、复制、病毒与寄主互作、转基因抗病毒、病毒抑制物等个方面中有着广泛的应用，为推动植物病毒学的研究起到了重要的作用。接种原生质体有用病毒粒体和病毒核酸两种方式。接种的基本要求是高浓度，侵染性强的病毒(或病毒核酸)悬液和新制备的高活性原生质体。目前转化原生质体主要有聚乙二醇(PEG)法、电激法和显微注射法等。其中PGE法可促进膜的融合，通过破环原生质体膜而协助病毒或核酸侵染，由于可以用少量的病毒核酸得到高感染率的原生质体，是目前常用的病毒RNA接种烟草原生质体的方法之一(陈占洲，李坏房.烟草原生质体在植物病毒研究中的应用.安徽农业科学，2006，34，1119-1122)。目前利用电击法将BNYVV体外转录物侵染甜菜(Joersbo M, and BrunstedtJ.1noculation of sugar beet protoplasts with beet necrotic yellow vein virusparticles by mild sonication. Journal of virological methods. 1990，29:63-69)和昆诺藜原生质体(Gilmer D.，Bouzoubaa S. , Hehn A. , Guilley H. , Richards K. , JonardG. Efficient cel1-to-celI movement of beet necrotic yellow vein virusrequires3/ proximal genes located on RNA2. Virology，992，189:40-47)以及BY-2悬浮细胞器有成功报道，但侵染系统寄主本生烟原生质体的体系尚未建立。随着BNYVV与本生烟寄主相互作用机制研究的不断深入，转化本生烟原生质体体系的建立也日渐重要。此外，由于电击转化法对实验中所用的仪器有较高的要求，从而限制BNYVV转染原生质方法的推广
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法。本专利技术所提供的用RNA病毒转化植物原生质体的方法，是将从感染RNA病毒的植物中提取的总RNA转入到植物原生质体中。所述方法特别适合于所述RNA病毒为多分体RNA病毒的情况。所述多分体RNA病毒是指病毒的基因组分布在不同的核酸链上，分别包装在不同的病毒粒体里，由于遗传信息分开了，单独一个粒体不能侵染，必需是一组几个同时侵染才能全部表达遗传特性。当带转化的所述RNA病毒为多分体RNA病毒时,米用上述方法，从感染了相应多分体RNA病毒的植物中提取植物总RNA，将其转化目的植物原生质体，这样的转化方法与传统转化方法(直接用病毒粒体或从病毒粒体中提取的病毒RNA，或利用病毒不同组分侵染性克隆的体外转录物混合后转化原生质体)相比，更加简化和节约成本，且对无该病毒侵染性克隆的实验室提供了开展实验的可能，其原因如下传统转化方法，转化时需要首先提纯病毒，而利用侵染性克隆体外转录物则需要摸索不同病毒核酸链的之间的配比；对于本专利技术所提供的转化方法来说，相应的多分体RNA病毒感染植株体后，该病毒在植物体内以其生理状态存在，所以用从感病毒的植物体中直接提取的总RNA转化目的植物原生质体不仅可以省略掉大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法，是将从感染RNA病毒的植物中提取的总RNA转入到植物原生质体中。

【技术特征摘要】
1.一种用RNA病毒转化植物原生质体的方法，是将从感染RNA病毒的植物中提取的总RNA转入到植物原生质体中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述RNA病毒为多分体RNA病毒。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述多分体RNA病毒为甜菜坏死黄脉病毒。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述植物原生质体为烟草原生质体。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述烟草原生质体为本生烟原生质体。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述本生烟原生质体来自...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩成贵，范慧艳，李大伟，于嘉林，王颖，张永亮，武文琦，王晓辉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：