一种玉米胚乳瞬时表达外源基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种玉米胚乳瞬时表达外源基因的方法，采用基因枪轰击转化授粉后9天的胚乳，轰击压力为900psi，轰击距离6cm。本发明专利技术解决了胚乳特异表达基因和启动子的瞬时表达难题，为胚乳特异性表达启动子活力验证，顺式作用元件鉴定，外源基因功能鉴定提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程技术，尤其涉及的是一种玉米胚乳瞬时表达外源基因的方法。
技术介绍
瞬时表达以活体植株作为实验材料，能够准确的反应基因在植物体内的实际功能，是一种快速、简便、高效的基因功能分析法，已经在多种植物中得到应用（Xu et.al.，2001；Mitsui et.al.，2003；Wydro et.al.，2006）。瞬时表达的转化方法有农杆菌转化法、基因枪轰击法以及原生质体转化法几种。这几种方法各有优劣，对于定性研究，农杆菌转化法较为理想，它操作简便，成本很低，缺点是每次只能转化一个质粒，由于转化效率的因素，不可能做到每次转化的细胞数都是一致的，因此，对于定量研究基因的功能是不够准确的。而且，由于物种的限制，一些植物组织农杆菌较容易侵染，转化效率较高，而许多植物，特别是单子叶植物的组织是不容易受农杆菌侵染的，不适合于用农杆菌侵染法。原生质体转化法在拟南芥和玉米黄化苗叶片以及水稻悬浮细胞中已经应用成功（Chiu et.al.，1996；Lu et.al.，1998；Sheen et.al.，2001），这种转化方法可以同时向细胞中转入多个质粒，因此，转化时可以加入一个含有报告基因的内参质粒，用来检测每次转化的效率，从而纠正每次实验中转化效率不同而产生的误差，对于要求定量研究是一个理想方法。虽然原生质体转化法是一种简便高效的转化方法，但是对于材料有很大的限制，有研究显示，拟南芥叶片的原生质体转化中，对于拟南芥的生长状态和生长时期有较高的要求（Sheen et.al.，2001）；玉米叶片原生质体转化也仅限于用2-3叶期的黄化苗制作的原生质体，而其它时期的叶片或含有叶绿体叶片或者其它组织原生质体转化目前非常困难（Chiu et.al.，1996）。水稻悬浮细胞的局限性主要在于悬浮细胞的获得，悬浮细胞的培养需要经过愈伤组织多次继代后，再用液体培养基振荡培养，使松散的愈伤组织分散到液体培养基中才能获得悬浮细胞（Lu et.al.，1998），这是一个耗时耗力的过程。除了以上三种材料外，其它植物材料的原生质体转化方法还鲜见报道。基因枪轰击转化法是一个物理过程，最大的优点是转化材料不受物种限制，而且操作简便。目前已经报道的基因枪轰击法介导的瞬时表达在多种植物中已经得到应用（Luan et.al.，1992；Xu et.al.，2001；Miki et.al.，2004；Selth et.al.，2004；Ueki et.al.，2009）。Marzábal等（1998）曾利用授粉后15-17天的玉米胚乳进行瞬时表达分析了γ-zein基因启动子中的两个顺式作用元件，我们根据Marzábal等报导的方法，在授粉后15-17天的玉米胚乳中没能成功瞬时表达外源基因。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种玉米胚乳瞬时表达外源基因的方法。本专利技术的技术方案如下：一种玉米胚乳瞬时表达外源基因的方法，采用基因枪轰击转化授粉后9天的胚乳，轰击压力为900psi，轰击距离6cm。本专利技术技术解决了胚乳特异表达基因和启动子的瞬时表达难题，为胚乳特异性表达启动子活力验证，顺式作用元件鉴定，外源基因功能鉴定提供技术支撑。附图说明图1为：授粉后不同天数的玉米胚乳在不同压力和不同轰击距离下的转化效率；A-F分别为：7DAP胚乳，9DAP胚乳，11DAP胚乳，13DAP胚乳，15DAP胚乳，20DAP胚乳；图2为部分轰击条件下胚乳的染色情况（7DAP胚乳，6cm）1-4：1300psi，1100psi，900psi，650psi；图3为ZmSSI启动子驱动的GUS在9DAP胚乳中的染色情况；1-2：轰击2枪，轰击1枪；具体实施方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。我们对玉米胚乳瞬时表达的转化条件进行了摸索和优化。结果发现，对于灌浆后不同时期的玉米胚乳，转化效率存在很大的差异，授粉后7-11天的胚乳能够有效进行转化，其中以授粉后9天的胚乳转化效果最好，而授粉11天以后，随着授粉后天数的推移，转化效果随之明显降低，几乎降为零（图1）。从剥离的胚乳外观可以发现，授粉后7-9天的胚乳呈现的是透明状，里面几乎没有淀粉等贮藏物质，而授粉后11天的胚乳已经开始变浑浊，说明细胞里面开始合成淀粉等贮藏物质了，随着授粉后天数的推移，胚乳由透明的果冻状逐渐变成白色的固体，而转化效果也随之迅速降低。说明胚乳细胞内淀粉等贮藏物质的合成是干扰胚乳基因枪转化的主要因素。其原因可能是授粉13天后胚乳细胞里造粉体内开始大量合成淀粉，众多含有淀粉的造粉体包围在胚乳的细胞核外，阻止了基因枪轰击的金粉进入细胞核，从而大大降低了转化效率。除材料的自身因素外，影响基因枪转化效率的因素还有轰击压力、轰击距离以及轰击的次数等。轰击压力大时，金粉的穿透力强，但是可能损坏细胞，轰击压力小时，能有效保护细胞，但穿透力弱，有可能不能将金粉有效打入细胞核。轰击距离的远近也是同理。对于以上几个参数的摸索发现，900psi的轰击压力能获得最高的转化效果（图2），轰击距离以6cm为最佳。对于授粉后9天的胚乳在最佳轰击条件下，轰击一次与轰击两次得到的结果差异不显著（图3），说明轰击次数对转化效率影响不明显。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本专利技术所附权利要求的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米胚乳瞬时表达外源基因的方法，其特征在于，采用基因枪轰击转化授粉后9天的胚乳，轰击压力为900psi，轰击距离6cm。

【技术特征摘要】
1.一种玉米胚乳瞬时表达外源基因的方法，其特征在于，采用基因枪轰击转化<...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄玉碧，胡育峰，张军杰，刘汉梅，刘应红，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：