本发明专利技术提供一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系及方法；所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。该转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗的苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。本发明专利技术在线性DNA或质粒DNA溶液中添加的穿膜肽，利用穿膜肽的特性将提高外源DNA片段整合到受体玉米基因组中的效率；本发明专利技术操作简便，无需昂贵仪器，生产成本低廉。本发明专利技术不受玉米基因型（自交系品种）和转化基因种类的限制，所以适用范围广泛；本发明专利技术采用线性DNA方法直接将外源基因导入玉米基因组，可去除质粒DNA骨架系列、特别是抗生素基因进入植物基因组，培育的转基因植物更安全，具有更好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物转基因领域，具体涉及；所述的转化 体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。该转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗的苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。
技术介绍
在玉米的转基因方法研究中，已经报道了多种可行方法可以将外源基因导入玉米中并得以稳定遗传，这些方法包括基因枪法，PEG介导法，电激法，农杆菌介导法和花粉管通道法。在这些转化方法中大多依赖于玉米的组织培养技术，玉米的组织培养受基因型和受体范围的限制比较大，而花粉管通道转化法不依赖于植物的组织培养技术，无需昂贵的仪器设备，不受自交系品种和转化基因类型的限制，以及可进行规模化转化等优点，因此备受人们的青睐。花粉管通道转化法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。周光宇(1979)认为可以利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道(花粉管引导组织)，经珠心通道将外源DNA携带进入胚囊，转化受体为受精卵或其前后的生殖细胞(精子或卵子)，由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，并且正进行活跃的DNA复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中，以达到遗传转化的目的(《远缘杂交的分子基础-DNA片段杂交假说的一个论证》遗传学报，1979，6 (4) :405_413)。但目前玉米花粉管通道法还存在转化效率较低的问题，转化率为O. 36%-5. 2%不等(关淑艳，张健华，柴晓杰，马义勇，曲同宝，孙波，王丕武；《花粉管通道法将淀粉分支酶基因反义表达载体转入玉米自交系的研究》；玉米科学，2005，13 (4) 13-15),(王罡，张艳贞，魏松红，胡应刚，吴颖，季静；《花粉管通道法将Bt毒蛋白基因导入优良玉米自交系》；吉林农业大学学报，2002，24 (4):40-44)。细胞膜是生物大分子进出细胞的天然屏障，蛋白及核酸等生物大分子不能够自由进入细胞。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides简称CPPs)是一类能够携带超出自身100倍的大分子物质包括蛋白质及核酸进入细胞的短肽，他们进入细胞的机制可能是利用短肽本身的带电特性而不依赖于胞吞作用(Chugh A. ,Eudes F. and Shim Y-S.Ce11-penetrating peptides:nanocarrier for macromolecule delivery in livingcells. IUBMB Life, 2010, 62 (3) : 183 - 193, )0近年来细胞穿膜肽用于动物细胞药物运输的研究成为热点，人们也开始利用穿膜肽在植物细胞中转运生物大分子的研究，发现它具有在动物细胞相似的功能，并且穿膜肽与DNA结合后具有保护DNA完整性防止DNA酶降角军的功倉泛(Chugh A. , Amundsen E. and Eudes F. Translocation of cell-penetratingpeptides and delivery of their cargoes in triticale microspores. Plant Cell Rep.(2009)28:801 - 810)。因此，在农业科研及生产中需要一种将细胞穿膜肽的特征与花粉管通道转化法相结合，转化效率高、操作简便、能将外源基因直接转入玉米的提高花粉管的转化体系及其转化方法。
技术实现思路
本专利技术提供；所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。该转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗的苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。本专利技术的转化效率明显提高。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的—种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。进一步地，所述的穿膜肽的氨基酸序列为 Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，如序列表中SEQ ID No 1所示。进一步地，所述的外源DNA为线性DNA、质粒DNA中的一种。进一步地，所述的质粒DNA为PGM-35SBar质粒载体；所述的线性DNA为通过PCR方法从PGM-35SBar质粒扩增去除骨架，核苷酸序列为序列表中如序列表中SEQ ID No :2所/Jn ο进一步地,所述的质粒载体PGM_35SBar的构建方法包括以下步骤A、将基因35Sbar连接到PGreen0229质粒载体，得到35Sbar_PGreen0229质粒载体；B、将基因Nos连接到所述的35Sbar_PGreen0229质粒载体，得到Nos-35Sbar-PGreen0229 质粒载体；C、将基因UBQI连接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，得到UBQI-Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，即为所述的质粒载体PGM_35SBar。本专利技术的目的是由以下另一技术方案实现的一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA、穿膜肽、Silwet L-77 ;所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3，所述的SilwetL-77占所述的转化体系的体积比为O. 01%-0. 05%。本专利技术的目的是由以下又一技术方案实现的一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化方法，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3 ;所述的转化方法的步骤为选取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞叶和花丝，将所述的转化体系滴在切口凹陷处。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果I、因为本专利技术在线性DNA或质粒DNA溶液中添加的穿膜肽，利用穿膜肽的特性将外源DNA顺利带进受精细胞，并进入细胞核，因此大大提高外源DNA片段整合到受体玉米基因组中的效率。2、因为本专利技术直接将含有目的基因的线性DNA或质粒DNA溶液转入玉米中，不依赖于玉米的组培再生体系，所以操作简便，无需昂贵仪器，生产成本低廉。3、因为本专利技术不受玉米基因型(自交系品种)和转化基因种类的限制，所以适用范围广泛。4、因为本专利技术采用线性DNA方法直接将外源基因导入玉米基因组，可以去除质粒DNA骨架系列、特别是抗生素基因进入植物基因组，所以培育的转基因植物更加安全，具有更好的应用前景。附图说明图I为实施例2中的质粒载体PGM_35SBar结构示意图。图2为实施例2的高抗除草剂的抗性植株的PCR扩增反应检测结果电泳图。图3为实施例2的Tl代转基因植株喷施除草剂7天后的照片。 具体实施例方式实施例I :一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。所述的穿膜肽的氨基酸序列如序列表中SEQ No 1所示。所述的外源DNA为线性DNA、质粒DNA中的一种。所述的线性DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ No :2所示；所述的质粒DNA为质粒载体 PGM-35SBar。一本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于：所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1？3。
【技术特征摘要】
1.一种含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的转化体系中，含有外源DNA和穿膜肽；所述的外源DNA和穿膜肽的质量比为1:1-3。2.根据权利要求I所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的穿膜肽的氨基酸序如序列表中SEQ ID No 1所示。3.根据权利要求I或2所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的外源DNA为线性DNA、质粒DNA中的一种。4.根据权利要求3所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的线性DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No :2所示，所述的质粒DNA为质粒载体 PGM-35SBar。5.根据权利要求4所述的含有穿膜肽的提高玉米转基因效率的转化体系，其特征在于所述的质粒载体PGM-35SBar的构建方法包括以下步骤 A、将基因35Sbar连接到PGreen0229质粒载体，得到35Sbar_PGreen0229质粒载体； B、将基因Nos连接到所述的35Sbar-PGreen0229质粒载体，得到Nos-35Sbar-PGreen0229 质粒载体； C、将基因UBQI连接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229质粒载体，得到UBQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴忠义，黄丛林，张秀海，罗昌，程曦，梁宏霞，李春华，翟亦倩，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：
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