本发明专利技术提供了一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物PCR分子标记方法，属于生物技术领域。设计四条标记引物，加入同一PCR反应体系对不同水稻DNA扩增，如果有439bp和292bp两条特征条带即为暗胚乳突变基因Wx-mq纯合体；如果有439bp和200bp两条带即为不含暗胚乳突变基因Wx-mq的纯合体；如果同时存在439bp、292bp和200bp的三条带，则为暗胚乳突变基因Wx-mq的杂合体。本发明专利技术不仅能快速、准确地鉴定水稻种质资源或其育种群体中是否含有暗胚乳突变基因Wx-mq，提高对暗胚乳突变基因Wx-mq的选择效率，加速暗胚乳、低直链淀粉含量水稻品种的选育进程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鉴定水稻暗胚乳突变基因/^-M7不同基因型的四引物PCR分子标记方 法，属于农业生物技术工程领域，专用于含暗胚乳突变基因/^-M7水稻资源的鉴定和品种 选育。
技术介绍
随着我国国民经济的发展和生活质量的提高，优良食味稻米开始展现出广阔的市场前 景，受到越来越多消费者的青睐。以日本优质大米“越光”和“一见钟情”为例，其价格为普通 大米的数倍，但市场仍供不应求(巩迎军等，中国农学通报，2008，24(12): 96-101)。研 究表明，直链淀粉是决定米饭质地和食味品质的重要因素。直链淀粉含量高，米饭质地硬， 粘性小，蓬松干燥，光泽差；直链淀粉含量低，则米饭表面光泽透亮，综合了糯米的柔性和粳 米的弹性，适口性好，食味品质佳，具有较高的商品性。因此，培育食味品质优良的低直链淀 粉含量水稻品种来满足日益增长的市场需求，已成为当前水稻品质育种一个重要的研究方 向(朱昌兰等，中国农业科学，2004，3(2) 81-88)。低直链淀粉含量基因是进行低直链淀粉水稻品种选育的重要遗传资源，目 前已知水稻中可供育种利用低直链淀粉含量突变基因有14个，它们大多由一对隐性 基因控制，且主要分布于水稻第6、9、10和12染色体上(Wang et al.,分子植物育 种，2009，7(6) 1070-1076)。其中Z^-M7是通过化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲 (N-methyl-N-nitrosourea,MNU)处理日本水稻品种越光，而获得的低直链淀粉含量变异基 因。该基因在腊质基因(权)编码区发生了两个碱基的替换，进而影响Wx蛋白的活性，造成 其直链淀粉含量的降低，随着直链淀粉含量的降低，携带该基因变异位点的水稻品种其胚 乳外观呈现云雾状、乳白色，透明度略差等暗胚乳的特性，故称为暗胚乳突变基因(Sato H, et al. Breeding Scif 2002，52 U) 131-135)。利用含该基因变异位点的水稻资源Milky QueenCKazuo I et al. , Bulletin of the National Institute of Crop Science, 2001, 3: 39-61)，各国育种家培育了大量直 链淀粉含量较低，食味品质优良的水稻品种，如“New-hikari”、“ Joiku 436”和“南粳46” 等(Tomit K, et al. , Bull Fukui Agr Exp Sta Series, 2007， 44: 1-20; Sato H, et al. , Breeding Sci, 2002，52(2) : 131-135;王才林等，中国水稻科学，2009，23(1) 25-30)。其中“南粳46”是江苏省第一个通过审定的低直链淀粉水稻品种，该品种米饭晶莹 剔透，口感柔软润滑，富有弹性，冷而不硬，食味品质极佳，先后获得江苏省粳稻优质米食味 品评第一名、全国优质粳稻优良食味品评优秀奖、全国“优质食味粳米”以及第九届中国优 质稻米交易博览会“金奖大米”的称号，其食味品质已接近日本优质稻米“越光”，被誉为“江 苏最好吃大米”(王才林等，中国水稻科学，2009，23(1): 25-30)。由此可见，/^-M7作 为水稻少数且效应较大的优质基因，在稻米食味品质改良中起着非常关键的作用。随着分子生物学的发展，基于DNA变异的分子标记在水稻遗传改良中发挥了非常 重要的作用。为提高暗胚乳突变基因Wx-mq水稻资源的鉴定和品种选育的效率，许多研究者进行了大量的尝试。Mto等利用Wx-mq基因第497位单核苷酸变异设计了能区分Wxiq 基因型的显性PCR分子标记，该标记能准确鉴定水稻中是否含有暗胚乳突变基因/&-M7， 但不能有效区别/^-M7的纯合和杂合基因型(Sato H, et al. , Breeding Sci, 2002, 52 (2) 131-135) ;Chen等根据该突变位点重新设计了能准确区分三种基因型的CAPS分子 标记，但由于涉及限制性内切酶的使用而存在操作烦琐，费用昂贵等一系列弊端(Chen et al. , Rice ^',2009, 16(2) 106-110)。因此，建立一种新的基于PCR技术的基因分型法 来快捷、准确地鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-im的基因型已成为育种应用中亟待解决的技 术难题。
技术实现思路
技术问题本专利技术针对利用普通分子生物学技术(如普通双引物PCR、DNA测序、PCR酶 切等)来区分暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型(特别是杂合基因型)，其试验流程较为烦 琐，费用昂贵的情况，根据/^-M7基因在位点上的单核苷酸变异，设计四条基因特异性引 物并采用一步PCR的方法来快速、准确地检测水稻暗胚乳突变基因/^-M7的不同基因型，以 达到资源鉴定和标记辅助育种的目的。技术方案一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的四引物PCR分子标记方法，其特征 在于用/^-M7基因特异性引物正向外引物(/&- 《-0-F)序列为 5，-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3， 反向外引物(权- 《-0_R)序列为 5，-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3’ 正向内弓丨物(Fng-I-F)序列为 5，-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3， 反向内引物(Wx-mq-1-R)序列为 5，-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3， 利用上述引物快速区分水稻暗胚乳突变基因Wx-mq不同基因型的PCR分子标记方法为(1)水稻植株基因组DNA的提取(SDS法)，参照Dellaporta S L, et al.，Plant Mol B iol Rep, 1983，1 (1) 19221.)；(2)将所述的四条分子标记引物Wx-Mj-Q-FJx-miHWx-Mi-1- 和『x-mq-1-议加入 同一 PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；20 μ L PCR 反应体系包括10 ng/yL 的 DNA 2.0 μ L,4 pmol/ μ L 的引物 2. 0 μ L ，其中引物权- 《-0-F、rn《-0-R、rn《-I-F和 rn《-I-R各 0. 5 yL，含 25 mmol/L MgCl2 的 10XPCR Buffer 2.0 μ L,2. 5 mmol/L 的 dNTP 0.4 μ L，5 U/μ L 的 7^《0· 5 μ I^PddH2O 13. 1 μ L ；PCR反应程序包括95 °C预变性5 min ；然后95°C变性30s、65°C复性30s、72°C延伸 lmin，循环35次；然后72°C延伸7min，10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。(3) 反应产物在质量比浓度为1. 5%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于 凝胶成像系统下观察，记载。如果有439bp两条特征条带，则为暗胚乳突变基因 Vx-mq的纯合体；如果有439 bp和200 bp两条特征条带，则为不含暗胚乳突变基因Wx-mq 的纯合体；如果同时存在439 bp,292 bp和200 bp的三条本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种鉴定水稻暗胚乳突变基因Ｗｘ－ｍｑ不同基因型的四引物ＰＣＲ分子标记方法，其特征在于：用Ｗｘ－ｍｑ基因特异性引物正向外引物Ｗｘ－ｍｑ－Ｏ－Ｆ序列为 ５＇－ＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＣＴＴＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣ－３＇反向外引物Ｗｘ－ｍｑ－Ｏ－Ｒ序列为 ５＇－ＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡ－３＇正向内引物Ｗｘ－ｍｑ－Ｉ－Ｆ序列为 ５＇－ＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＡＴＣＧ－３＇反向内引物Ｗｘ－ｍｑ－Ｉ－Ｒ序列为 ５＇－ＧＴＣＧＡＴＧＡＡＣＡＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＴ－３＇扩增水稻品种的基因组ＤＮＡ，如果同时有４３９ ｂｐ和２９２ ｂｐ两条特征条带，则为暗胚乳突变基因Ｗｘ－ｍｑ的纯合体；如果同时有４３９ ｂｐ和２００ ｂｐ两条特征条带，则为不含暗胚乳突变基因Ｗｘ－ｍｑ的纯合体；如果同时存在４３９ ｂｐ、２９２ ｂｐ和２００ ｂｐ的三条特征条带，则说明该植株是暗胚乳突变基因Ｗｘ－ｍｑ的杂合体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张亚东，赵庆勇，周丽慧，姚姝，陈涛，朱镇，赵凌，王才林，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84
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